异种同源钙激活Cl～-通道DNA疫苗对小鼠哮喘模型的防治作用
发布时间：2021-01-25 11:10
【研究背景】支气管哮喘（哮喘）是一个严重危害人类健康的疾病，目前尚缺少有效的防治方法。哮喘的发病机制复杂，涉及多种效应细胞及其分泌的炎症介质。气道上皮细胞就是其中具有重要作用的效应细胞之一，它位于外界刺激与机体内环境接触的第一环节，在哮喘中处于持续损伤与异常修复的状态，能够分泌多种炎症介质，影响周围组织及炎性细胞的结构与功能，被认为是哮喘发生的始动部位之一。近年的研究表明，上皮中杯状细胞特有的一种钙激活Cl-通道（CLCA）是上皮杯状细胞参与哮喘发生的主要功能单位，阻断CLCA是防治哮喘具有潜在前景的措施。这种功能独特的CLCA已知基因序列有：人hCLCA1、小鼠mCLCA3。以CLCA为作用靶位的哮喘防治疫苗尚无研究。 【目的】1、利用hCLCA1和mCLCA3的异种同源性，构建人源hCLCA1 DNA疫苗，肌注法接种给小鼠，试图突破小鼠自我的免疫耐受屏障，诱导其产生针对自身mCLCA3胞外肽段的交叉抗体，以期达到阻断气道mCLCA3通透活性、防治哮喘发生的目的。2、利用小鼠在体哮喘模型、杯状细胞体外培养细胞模型，初步探讨该疫苗防治哮喘效应的机制。 ...
【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
hCLCAI基因的部分测厅结果
图1.3mcLcA3部分测序结果F191.3PartofthesequeneingresultofhCLCAIgene1.2.2DNA疫苗的合成由于载体psecTagZ一B中没有Nhol酶切位点，故首先采用PCR法重新设计hCLCAIcDNA酶切位点。考虑到质粒模板扩增效率高，在上游引物3’端完全互补的同时，将5’端改为Hindm序列。PCR结果可见2.7kb左右有特异条带。测序鉴定正确后，将该cDNA与psecTagZ一B均采用Hindlll、Xhol酶切并连接。psecTagZ一B爪CLCAI的双酶切鉴定证实该质粒构建成功(图1.4)。1.2.3mCLCA3胞外肤段的克隆、表达与纯化(l)克隆:N一ED、M一ED和C一ED三个胞外肤段的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳结果显示，分别在59lbp、186bp、687bp处出现预期条带(图
经BamHI和Ec口Rl双酶切后，与分别同样酶切的载体连接，重图1，4图1.4pseeTagZ一B小CLcAI重组质粒酶切鉴定结果F191.4IdentifieationofreeombinentPlasmidsofPSee几92一BM:DNAmaker:l:DigestedPSeeTagZ一B/hCLCAI图1.5mCLCA3三个胞外段基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析F191.5AnalysisofPCRProduetofthreeextraeellulardomainsofmCLCA3byagarosegeleleetroPhoresisM:DL2000DNAmarker:l:N一EDgene:2:M一EDgene:3:C一EDgene构pRsET-A月呵一ED、pGEX一2不l服一ED和pRsE下刀e一En原核表达质粒，酶切鉴定正确(图1.6)。由于M一ED分子量过小，为方便鉴定与纯化，故选择与GST融合表达的方式。图1.6mCLCA3三个胞外肤段原核表达质粒的酶切鉴定Fig1.6IndentifieationofexPressionPlasmidsofthreeextracellulardomainsofmCLCA3A:PRSET-A/N一ED;B:PGEX一2T-1/M一ED:C:PRSET-A/C一ED(2)表达:三种重组质粒经过转化丑eoliBL21(nE3)和IPTG诱导表达，SDS一PAGE检测结果显示，与转化空载体的相应对照组相比，在Mrx103为25.21、33.94和29.31处分别出现浓重条带(图1.7)，分别与6His一N一ED、GST-M一ED和6His一C一ED对应。49
【参考文献】：
期刊论文
[1]比较基因组学研究与应用中的辩证思维[J]. 宋立强,李妍,郭照江. 医学与哲学. 2004(01)
[2]睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J]. 王莉,李青,郭爱林,张丰,郭斌,樊代明. 细胞与分子免疫学杂志. 2003(02)
[3]肾上腺素诱导的血管平滑肌细胞C1-电流及其与Ca2+运动的关系[J]. 阮红梅,关永源,贺华,丘钦英. 中国动脉硬化杂志. 2002(02)
[4]Cl-通道在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用[J]. 肖贵南,关永源,贺华. 中国动脉硬化杂志. 2001(04)
本文编号：2999124
【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
hCLCAI基因的部分测厅结果
图1.3mcLcA3部分测序结果F191.3PartofthesequeneingresultofhCLCAIgene1.2.2DNA疫苗的合成由于载体psecTagZ一B中没有Nhol酶切位点，故首先采用PCR法重新设计hCLCAIcDNA酶切位点。考虑到质粒模板扩增效率高，在上游引物3’端完全互补的同时，将5’端改为Hindm序列。PCR结果可见2.7kb左右有特异条带。测序鉴定正确后，将该cDNA与psecTagZ一B均采用Hindlll、Xhol酶切并连接。psecTagZ一B爪CLCAI的双酶切鉴定证实该质粒构建成功(图1.4)。1.2.3mCLCA3胞外肤段的克隆、表达与纯化(l)克隆:N一ED、M一ED和C一ED三个胞外肤段的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳结果显示，分别在59lbp、186bp、687bp处出现预期条带(图
经BamHI和Ec口Rl双酶切后，与分别同样酶切的载体连接，重图1，4图1.4pseeTagZ一B小CLcAI重组质粒酶切鉴定结果F191.4IdentifieationofreeombinentPlasmidsofPSee几92一BM:DNAmaker:l:DigestedPSeeTagZ一B/hCLCAI图1.5mCLCA3三个胞外段基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析F191.5AnalysisofPCRProduetofthreeextraeellulardomainsofmCLCA3byagarosegeleleetroPhoresisM:DL2000DNAmarker:l:N一EDgene:2:M一EDgene:3:C一EDgene构pRsET-A月呵一ED、pGEX一2不l服一ED和pRsE下刀e一En原核表达质粒，酶切鉴定正确(图1.6)。由于M一ED分子量过小，为方便鉴定与纯化，故选择与GST融合表达的方式。图1.6mCLCA3三个胞外肤段原核表达质粒的酶切鉴定Fig1.6IndentifieationofexPressionPlasmidsofthreeextracellulardomainsofmCLCA3A:PRSET-A/N一ED;B:PGEX一2T-1/M一ED:C:PRSET-A/C一ED(2)表达:三种重组质粒经过转化丑eoliBL21(nE3)和IPTG诱导表达，SDS一PAGE检测结果显示，与转化空载体的相应对照组相比，在Mrx103为25.21、33.94和29.31处分别出现浓重条带(图1.7)，分别与6His一N一ED、GST-M一ED和6His一C一ED对应。49
【参考文献】：
期刊论文
[1]比较基因组学研究与应用中的辩证思维[J]. 宋立强,李妍,郭照江. 医学与哲学. 2004(01)
[2]睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J]. 王莉,李青,郭爱林,张丰,郭斌,樊代明. 细胞与分子免疫学杂志. 2003(02)
[3]肾上腺素诱导的血管平滑肌细胞C1-电流及其与Ca2+运动的关系[J]. 阮红梅,关永源,贺华,丘钦英. 中国动脉硬化杂志. 2002(02)
[4]Cl-通道在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用[J]. 肖贵南,关永源,贺华. 中国动脉硬化杂志. 2001(04)
本文编号：2999124
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