产MCR-8.2和NDM-1的高黏性肺炎克雷伯菌耐药和毒力分子特征研究

发布时间：2021-05-26 20:58

　　目的:对同时耐替加环素、多粘菌素且具有高黏表型的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP）KP18-29 的耐药组及毒力特征进行深入研究,阐明其产生广泛耐药及毒力的分子机制。方法:（1）采用微量肉汤稀释法和琼脂稀释法测定临床治疗肠杆菌科细菌感染常用的18种抗菌药物对KP18-29的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）;（2）基于 Illumina Miseq 和 PacBio RSII 平台对 KP18-29进行全基因组测序,分析KP18-29的耐药组及携带的毒力基因;（3）拉丝实验确定KP18-29的高黏性表型;基于小鼠脓毒症模型评价KP18-29的高毒力表型;（4）接合转移实验确定KP18-29携带的mcr-8.2基因的可转移性及其介导多粘菌素耐药的功能。（4）初步探索MCR-8.2蛋白的催化功能,对MCR-8.2蛋白催化结构域进行表达和纯化。结果:（1）肺炎克雷伯菌KP18-29仅对磷霉素敏感,对包括多粘菌素和替加环素在内的所有其他检测药... 

【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校

【文章页数】：114 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表(Abbreviations)
第一章 前言
    1.1 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)概述
        1.1.1 CRKP简介
        1.1.2 CRKP在国内、外的流行
        1.1.3 高毒力肺炎克雷伯菌
        1.1.4 CR-hvKP的出现及危害
    1.2 可水平转移的多粘菌素耐药基因mcr
        1.2.1 mcr基因的简介
        1.2.2 mcr-8基因的发现
        1.2.3 mcr基因在CRE中的传播
    1.3 结语
第二章 同时耐替加环素和多粘菌素CRKP的发现及分子特征研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 实验仪器
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 溶液及培养基的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)测定
        2.2.2 拉丝实验
        2.2.3 耐药基因的检测
        2.2.4 接合转移
        2.2.5 电转实验
        2.2.6 S1-PFGE和Southern杂交
        2.2.7 全基因组测序
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 药敏结果和黏性表型
        2.3.2 定位分析
        2.3.3 全基因组测序
        2.3.4 mcr-8.2质粒分析
    2.4 讨论
第三章 KP18-29的毒力分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 实验动物
        3.1.3 实验仪器
        3.1.4 实验试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 小鼠致死量测定
        3.2.2 组织HE染色
        3.2.3 毒力因子推定
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 小鼠致死率测定和组织病理切片
        3.3.2 毒力因子分析
    3.4 讨论
第四章 磷酸乙醇胺转移酶MCR-8.2蛋白的表达和纯化
    4.1 实验材料
        4.1.1 表达菌株及载体
        4.1.2 实验仪器
        4.1.3 实验试剂
        4.1.4 引物设计及合成
        4.1.5 溶液的配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 目的基因的扩增
        4.2.2 载体质粒的提取
        4.2.3 载体质粒的酶切
        4.2.4 目的基因PCR产物及酶切载体的纯化
        4.2.5 感受态细胞的制备
        4.2.6 MCR-8.2重组质粒的构建与鉴定
        4.2.7 目的蛋白的小量表达
        4.2.8 目的蛋白的大量表达及纯化
    4.3 实验结果
        4.3.1 以pET-28a(+)为载体的蛋白小量表达
        4.3.2 以pSUMO为载体的蛋白小量表达
        4.3.3 以pGEX-6P-1为载体的蛋白小量表达
        4.3.4 不同诱导温度的蛋白小量表达
        4.3.5 不同盐浓度的蛋白小量表达
        4.3.6 部分片段的蛋白大量表达与纯化
    4.4 讨论
结论与创新点
参考文献
附录
个人简历
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Determination of 50% endpoint titer using a simple formula[J]. Muthannan Andavar Ramakrishnan.  World Journal of Virology. 2016(02)



本文编号：3207056