Isl1在哺乳动物肺发育过程中的功能研究

发布时间：2021-06-16 22:11

　　肺是人体的呼吸器官,位于胸腔,主要由上皮、支气管、肺泡等组成,是实现机体与外界环境气体交换,以维持人体生命活动的重要器官。肺发育异常会可导致多种严重的缺陷疾病,如先天性囊性肺疾病、肺发育不良或支气管肺发育不良等,正常的肺发育过程对出生后的生存至关重要。在本课题中,主要探究Isl1是如何调控肺早期发育的分子机理,具体研究Isl1基因在肺上皮中的功能。我们利用Shh ^Cre小鼠与Isl1^flox/flox小鼠交配,获得在肺上皮细胞中条件性敲除的突变体小鼠(Shh ^Cre;Isl1^flox/flox)。研究发现,Isl1突变型小鼠出生致死,P0天HE染色结果显示肺泡无张开。通过免疫组织学方法检测细胞增殖和凋亡情况发现,Isl1突变型小鼠从E16.5天开始肺部细胞增殖异常升高,而细胞凋亡无差异。利用RNA-Seq测序筛选出Isl1可能的靶分子,并通过原位杂交实验进一步验证差异表达基因,P0天突变型小鼠中AT2和AT1型上皮细胞标记基因SLC34A2、SPC及AQP5表达显著下降,Notch的配体Dlk1的表... 

【文章来源】：杭州师范大学浙江省

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

小鼠和人类肺部发育时间表[5]

d1(Dlk1)是Notch受体的非经典配体。Dlk1是一种跨膜蛋白，随着妊娠的进行，Dlk1的表达会随着细胞的分化而降低，在大多数组织中，出生后不存在Dlk1的表达[18]。成年人中，Dlk1仅在少数组织和祖细胞中表达，但在疾病和再生的过程中会重新表达[19]。Dlk1也是正常骨骼肌发育和再生所必需的[20]。研究表明，Dlk1对AT2-AT1的分化和肺泡修复至关重要，在肺损伤修复的过程中Notch信号在AT2上皮细胞中被激活，进而刺激AT2细胞的增殖，但当Dlk1表达到一定程度后会进一步抑制Notch信号，从而促进AT2上皮细胞向AT1上皮细胞的分化[21]。图1-2小鼠肺发育相关的细胞谱系[12]。（A），血管平滑肌（VSM），气道平滑肌（ASM），外周细胞（Pericytes）和近端血管内皮细胞都来源于心肺祖细胞（CPP），而远端血管内皮细胞来源于VE-cadherin+祖细胞。（B），nkx2.1+内胚层细胞产生sox2+近端祖细胞和sox9+/id2+远端祖细胞。近端祖细胞产生神经内分泌（NE）细胞、纤毛细胞、分泌细胞和粘膜细胞。远端祖细胞产生I型和II型肺泡上皮细胞

杭州师范大学硕士学位论文实验内容与设计52实验内容与设计2.1突变体小鼠的获得为了研究Isl1在小鼠肺早期发育中的功能，我们利用条件性基因敲除技术（具体是Cre/Loxp的方法）来构建小鼠肺上皮细胞特异性基因敲除小鼠进行研究。实验采取ShhCre小鼠与Isl1flox/flox小鼠交配，获得在肺上皮细胞中特异性敲除Isl1基因的突变体小鼠（ShhCre;Isl1flox/flox）。图2-1获得突变体小鼠的繁殖图2.2实验内容（1）获得实验突变小鼠、基因型鉴定、样品和组织收集、处理样品。（2）WholemountX-gal染色检测ShhCre小鼠Cre酶活性及Isl1基因在早期胚胎小鼠肺部的表达特异性。（3）收集不同胚胎期和P0时期的实验小鼠肺组织做HE染色实验，观察对照小鼠与Isl1敲除小鼠肺组织的形态结构差异。（4）免疫组织化学方法检测对照小鼠与突变体小鼠的肺部细胞增殖情况。（5）免疫组织化学方法检测对照小鼠与突变体小鼠的肺部细胞凋亡情况。（6）利用RNA-Seq来筛选并分析出可能的存在的Isl1的靶分子。（7）采用原位杂交的方法来验证存在差异的基因。


本文编号：3233884