HCMV对人肺成纤维细胞致纤维化介质表达、上皮细胞A549转分化的影响及有关信号机制

发布时间：2017-04-25 10:24

  本文关键词：HCMV对人肺成纤维细胞致纤维化介质表达、上皮细胞A549转分化的影响及有关信号机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:进行性肺纤维化是结缔组织病患者死亡的重要原因之一。大量研究表明病毒感染可以促进纤维化疾病的发生。HCMV(人巨细胞病毒)是自身免疫疾病发生发展的重要诱因之一。一方面,HCMV编码的多种基因产物紊乱正常的人体免疫功能进而形成持续感染,另一方面,HCMV同时可编码多种基因产物促进细胞增殖,进而促发纤维化。结缔组织疾病常在自身免疫紊乱的基础上发生肺组织纤维化,称之为结缔组织相关性肺纤维化(CTD-ILD)。目前,自身免疫疾病患者伴发肺间质纤维化的机制尚不清楚,治疗手段有限。已经有研究表明疱疹病毒家族中的Epstein-Barr virus(EBV)和human herpesvirus 6(HHV-6)在自身免疫疾病的发生中起重要作用。且有研究发现,在血管自身免疫疾病中患者外周血中有大量HCMV(人巨细胞病毒)感染标志的CD4+T细胞存在。由此,我们设想HCMV可能籍其促纤维化性作用进而参与CTD-ILD的发生发展。研究目的:本研究通过体外试验观察HCMV病毒株感染的人外周血单个核细胞对肺成纤维细胞重要的致纤维化介质表达、人肺泡上皮细胞A549细胞因子、EMT(上皮-间充质转化)的影响及HCMV重要的结构蛋白之一US28的作用,旨在探讨HCMV免疫抑制患者肺纤维化发生发展中的作用机制进而为HCMV相关性肺纤维化防治提供更多的理论基础。研究方法:HCMV病毒株AD169感染人外周血单个核细胞(PBMC)后与成纤维细胞共培养,成纤维细胞相关细胞因子的变化将培养的病毒用TCID50(即半数组织培养感染剂量)方法定量后,按MOI(感染复数)为0.1感染外周血单个核细胞1小时后,弃去上清,用PBS(磷酸缓冲盐溶液)反复清洗2次,离心重悬后与成纤维细胞共培养,分别在6h,12h,24h收取细胞,提取RNA逆转录后,采用荧光定量PCR技术检测IL-10,IFN-γ,TNF-α,IP-10,IL-17A,IL-6,TGF-β表达的变化。第二部分HCMV重要的结构蛋白之一US28作用于上皮细胞A549引起的细胞因子、表型转化及IL6-p STAT3信号的作用细胞铺种至六孔培养板24小时后,用脂质体转染法分别将质粒空载体及含有目的片段US28的质粒转染人肺泡上皮细胞A549,24小时后收取细胞,提取RNA,逆转录后采用荧光定量PCR技术检测指标IL-10,IL-6,TGF-β,Fibronectin,E-cadherin量的变化,western bloting检测蛋白水平间充质转化表型及信号通路的变化。研究结果:第一部分HCMV病毒株AD169感染外周血单个核细胞(PBMC)后与成纤维细胞共培养,成纤维细胞相关细胞因子的变化筛查了病毒感染后与免疫抑制、纤维化相关的细胞因子的变化,发现免疫抑制性细胞因子IL-10在各个时间点都明显升高,而具有抗病毒效应的IFN-γ却随着时间的迁移逐渐降低,与纤维化相关的细胞因子TNF-α,IP-10,IL-17A,IL-6均表现出不同程度的升高,特别是IL-6升高尤为明显,但相对应的TGF-β却无明显变化。第二部分HCMV重要的结构蛋白之一US28作用于上皮细胞A549引起的细胞因子及通过US28-IL6-pstat3路径引起的相关表型的变化以US28质粒转染A549细胞,观察刺激后细胞因子、EMT部分标志物的变化情况,结果发现,转染了US28的上皮细胞免疫抑制性细胞因子IL-10表达有升高趋势,IL-6明显升高,而TGF-β却明显下降,上皮间充质转化(EMT)的标志fibronectin升高,而相应的上皮性标志E-cadherin表达降低。蛋白水平表现出与转录水平一致的结果,fibronectin明显升高而E-cadherin明显下降,并且p-STAT3表达也是增高的,而其抑制剂降低p-STAT3水平,同时上皮性细胞标志E-cadherin水平升高而间充质细胞标志fibronectin降低。结论:1.HCMV感染可诱导人肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞A549纤维化相关的细胞因子表达与表型转化;2.US28是HCMV诱导肺成纤维细胞、A549纤维化介质及表型转化的重要结构蛋白之一,IL-6/stat3是上述过程的关键信号通路。
【关键词】：
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-18
• 第一部分HCMV感染外周血单个核细胞（PBMC）后对成纤维细胞致纤维化介质的影响18-33
• 材料（资料、内容）与方法18-29
• 结果29-30
• 讨论30-33
• 第二部分HCMV重要的结构蛋白之一US28对肺泡上皮细胞A549致纤维化细胞因子表达、表型的影响及信号机制33-48
• 材料（资料、内容）与方法33-45
• 结果45-46
• 讨论46-48
• 结论48-49
• 参考文献49-56
• 综述56-79
• 参考文献61-79
• 附录79-84
• 作者简介及读研期间主要成果84-85
• 致谢85-86

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