miR-181b抑制TGFBR1表达在肺纤维化过程中的作用及机制研究
本文关键词：miR-181b抑制TGFBR1表达在肺纤维化过程中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的：研究miR-181b对肺纤维化过程的调控作用，并对其作用机制进行进一步探讨。 方法：收集7例特发性肺纤维化患者和9例正常人肺活检组织，并取正常小鼠和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型的肺组织，提取RNA检测miR-181b水平。将A549细胞分为control组、mimic-NC组、mimic组、inhibitor组和inhibitor-NC组。control组无干预；mimic组加入miR-181b的激动剂mimic；inhibitor组加入miR-181b的抑制剂inhibitor，mimic-NC组和inhibitor-NC组分别为mimic组和inhibitor的阴性对照组，加入无活性的microRNA。转染后，通过western blot检测TGFBR1表达。同时，将TGFBR1mRNA3’UTR构建入luciferase报告系统（TGFBR1-3’UTR-wt），同时将突变后的TGFBR1mRNA3’UTR也插入luciferase报告系统中（TGFBR1-3’UTR-mut1，TGFBR1-3’UTR-mut2和TGFBR1-3’UTR-mut3）。然后将miR-181b与luciferase空质粒（empty vector）或TGFBR1-3’UTR-wt质粒或TGFBR1-3’UTR mut1/2/3质粒共同转染至HEK-293细胞中，检测各组细胞中的荧光强度。将30只小鼠分为对照组、miR-181b组和GFP组，，每组10只小鼠。对照组小鼠不作任何处理，miR-181b组经尾静脉注射入rAAV-miR-181b载体使miR-181b在小鼠体内过表达；GFP组经小鼠尾静脉注射入rAAV-GFP载体。所有小鼠经博来霉素刺激诱导特发性肺纤维化模型，模型制作成功后，处死小鼠取肺组织，HE染色和Masson染色检测肺病理变化和胶原沉积情况，western blot检测TGFBR1、磷酸化SMAD2和SMAD3蛋白的表达。 结果：IPF病人肺组织中的miR-181b表达水平只有正常人肺组织中的1/3，而与正常小鼠相比，IPF小鼠肺组织中miR-181b表达水平更低，约下调4倍左右。miR-181b mimic可显著降低A549细胞中TGFBR1水平（p0.05），而miR-181b inhibitor可显著升高A549细胞中TGFBR1水平（p0.05），5组细胞中的TGFBR1mRNA水平并无明显差异。luciferase assay结果显示转染miR-181b后，TGFBR1-3’UTR-wt组荧光强度明显低于其阴性对照组（miR-con），和TGFBR1-3’UTR-mut1/2组荧光强度也不同程度的低于其阴性对照。而TGFBR1-3’UTR-mut3组或空质粒组（empty vector）荧光强度与其阴性对照无明显差异。miR-181b组小鼠肺纤维化程度明显高于BLM组和GFP组，但仍高于对照组；BLM组小鼠肺纤维化程度与GFP组无明显差异。转染AAV5-miR-181b的IPF小鼠模型肺组织内TGFBR1、p-SMAD2和p-SMAD3的表达量明显低于对照组和Vector组小鼠（p0.05）。 结论：miR-181b在特发性肺纤维化疾病进程中表达下调，过表达miR-181b可在转录后水平通过下调靶蛋白TGFBR1表达，阻断肺组织中TGF-β信号通路的传导，从而减轻肺纤维化的程度。
【关键词】：特发性肺纤维化 转化生长因子β 微小RNA 博来霉素 腺相关病毒
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563
【目录】：
- 中文摘要4-6
- Abstract6-8
- 目录8-11
- 第1章 绪论11-27
- 1.1 引言11-12
- 1.2 综述12-27
- 1.2.1 概述12-13
- 1.2.2 特发性肺纤维化的发病机制13-18
- 1.2.3 特发性肺纤维化的诊断18-21
- 1.2.4 特发性肺纤维化的治疗21-26
- 1.2.5 总结与展望26-27
- 第2章 资料和方法27-40
- 2.1 实验材料27-29
- 2.1.1 实验器材27
- 2.1.2 主要试剂27-29
- 2.1.3 受试人群29
- 2.1.4 实验动物29
- 2.2 实验方法29-40
- 2.2.1 实验分组与处理方法29-30
- 2.2.2 qRT-PCR 检测 miRNAs 和 mRNA 表达30-33
- 2.2.3 寡核苷酸（miRNA）的转染33-34
- 2.2.4 miR-181b 靶基因预测34
- 2.2.5 荧光素酶报告基因分析34-35
- 2.2.6 IPF 小鼠模型的建立35
- 2.2.7 肺组织学染色35-36
- 2.2.8 western blot 检测36-38
- 2.2.9 统计学分析38-40
- 第3章 结果40-45
- 3.1 miR-181b 在 IPF 肺组织中表达下调40
- 3.2 miR-181b 减轻 IPF 的肺纤维化改变40-41
- 3.3 TGFBR1 是 miR-181b 可能的作用靶点41-42
- 3.4 miR-181b 下调 A549 细胞 TGFBR1 蛋白表达42-43
- 3.5 miR-181b 可与 TGFBR1 mRNA 3’UTR 端结合43-44
- 3.6 miR-181b 阻断 IPF 肺组织内 TGF-β 信号通路的传导44-45
- 第4章 讨论45-49
- 第5章 结论49-50
- 参考文献50-59
- 附录59-60
- 作者简介及在学期间所取得的科研成果60-61
- 致谢61
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本文编号：326800
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