盐皮质激素受体在博来霉素诱导肺纤维化中的作用

发布时间：2017-04-27 16:01

  本文关键词：盐皮质激素受体在博来霉素诱导肺纤维化中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）是一种原因不明的进展性、致死性的纤维化性间质性肺炎。目前，IPF的发病机制尚不明确，缺乏有效治疗手段。IPF患者诊断后的平均生存时间仅为2.5-3.5年[1]。近些年来，涌现出大量关于IPF发病机制及治疗方法的研究。盐皮质激素受体（Mineralocorticoid receptor, MR）是一种典型的胞核甾体类激素受体，醛固酮是其选择性配体。MR在肾脏、肺脏、心、血管、脑以及免疫系统等部位均有表达[2]。近些年研究表明，MR参与了巨噬细胞的活化表型调节[3]，MR与纤维化过程有着密切的联系[4]。但是MR是否参与了肺纤维化的发病过程及其作用机制尚不明确。 本研究拟使用博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，首先，检测MR在肺纤维化过程中mRNA和蛋白的表达情况，探讨其在肺纤维化进展过程中的作用；其次，通过使用MR抑制剂（螺内酯）阻断MR，观察阻断MR后，肺纤维化程度的变化；最后，通过检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscleactin, α-SMA）、单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）、转化生长因子-β（Transforming growth factor-β, TGF-β）的表达水平，探讨MR在肺纤维化发病过程中发挥其病生理作用的分子机制。此外，采用RNA干扰技术，构建稳定干扰MR基因的小鼠巨噬细胞RAW264.7，观察对其增殖和凋亡等生物学特性的影响。 方法：1）126只6-8周龄C57BL/6小鼠，随机分为对照组（Control）、博来霉素组（Bleo）和螺内酯干预组（Bleo+Spiro），每组42只。气管内一次性滴注博来霉素（2.5mg/Kg）溶液建立实验性小鼠肺纤维化模型，对照组采取气管内滴注同等体积生理盐水。螺内酯干预组按螺内酯20mg/Kg经灌胃给药。于模型建立完成后第12h、1d、2d、3d、7d、14d、28d处死小鼠，取出肺脏，用于进一步分析。使用生理盐水对每组一半的小鼠肺脏进行常规灌洗。灌洗后的肺组织，经4%多聚甲醛溶液固定，常规切片（5μm），采用H.E.染色、Masson染色的方法进行组织学分析。采用α-SMA免疫荧光染色分析小鼠肺脏中α-SMA表达水平。未经灌洗的肺组织用于mRNA分析和Western-Blot检测，采用Real-time PCR法检测各组肺组织中Col1(Collagen1)、Col3(Collagen3)、TGF-β、MCP-1及MR mRNA的表达水平。采用Western-Blot法检测MR蛋白表达水平。 2）针对MR基因设计合成重组MR shRNA质粒，脂质体法转染质粒至RAW264.7，经G418筛选后获得稳定表达细胞株。细胞分为3组：野生型(WT)、阴性对照（NC）组和干扰（shMR）组。荧光显微镜下观察确定细胞的转染效率；Real-time PCR法检测细胞中MR mRNA的表达；CCK-8方法检测细胞增殖活性；流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡情况。 采用SPSS19.0软件进行统计分析，数据均采用均数±标准差（x s）表示。组间的比较采用t检验和方差分析。P0.05表示差异具有统计学意义。 结果：1）H.E.及Masson染色结果显示，与对照组小鼠相比，博来霉素组及螺内酯干预组小鼠在染博来霉素后经历了典型的急性炎症期（12h-3d）、纤维化进展期（14d）和纤维化晚期（28d）。较博来霉素组相比，螺内酯干预后的小鼠肺脏早期炎症反应明显减轻，炎症细胞浸润减少；在纤维化进展期（14d），纤维化程度显著减轻（P0.001）。 2）α-SMA免疫荧光染色结果显示，在给予博来霉素14d后，博来霉素组小鼠肺脏中α-SMA表达量显著高于螺内酯干预组和对照组。 3）博来霉素组小鼠在急性炎症期（12h-3d）肺组织中MR mRNA表达水平升高，明显高于对照组（P0.05），随后逐渐下降，，在第14d降至最低，与对照组表达水平接近，而后再次升高，在纤维化晚期（28d）明显高于对照组（P0.05）。 螺内酯干预可以有效降低MR mRNA表达水平。螺内酯干预组小鼠在给予博来霉素后第14d，Col1和Col3mRNA表达水平显著降低（P0.05）。 博来霉素组小鼠在急性炎症期（12h-3d），肺组织中MCP-1mRNA的表达显著增高（P0.05）。随着时间推移，逐渐下调。螺内酯干预可以下调MCP-1mRNA的表达。 在给予博来霉素后第3d，与博来霉素组相比，螺内酯干预组小鼠肺组织中TGF-β mRNA的表达显著增高（P0.05）；第14d，博来霉素组小鼠肺组织中TGF-β mRNA的表达水平则明显高于螺内酯干预组（P0.05）。 4）博来霉素组小鼠肺组织中MR蛋白表达水平在急性炎症期（12h-3d）升高，明显高于对照组（P0.05），随后逐渐下降。至第7d，MR蛋白表达水平迅速下调，在给予博来霉素14d后降至最低，与对照组表达水平接近，至纤维化晚期（28d）再次升高，显著高于对照组（P0.05）。螺内酯干预可以有效抑制MR蛋白水平的表达。 5）MR shRNA能明显抑制RAW264.7细胞的MR基因表达，抑制率70%以上。 6）从第3天开始，shMR组细胞的生长速度明显低于NC和WT组(P0.05)，说明MR shRNA能明显抑制细胞增殖。WT、NC和shMR组的增殖指数分别为（37.2±0.5）%、（37.5±1.6）%和（31.0±1.3）%，shMR组的细胞周期出现改变，S期和G2/M期比例明显下降，增殖指数下降（P0.05）。 7）WT、NC和shMR组的细胞凋亡率分别为（2.18±0.36）%、（6.65±0.81）%和（7.70±1.34）%，shMR组略高于NC组，但二者无统计学差异（P＞0.05）。 结论：1）MR的表达在博来霉素诱导肺纤维化过程中呈现明显的动态变化，并参与了肺纤维化的发病过程；2）阻断MR在纤维化进展期（14d）可以明显减轻博来霉素诱导的肺纤维化程度；3）MR可能通过在急性炎症期诱导分泌大量MCP-1，激活炎症反应，并在纤维化进展期，促进TGF-β的表达，促进了肺纤维化的进展，此外，MR还可能通过直接促进成纤维细胞转化为表达α-SMA的肌成纤维细胞，在肺纤维化的发病过程中发挥重要的作用。4）MR shRNA能够明显抑制RAW264.7细胞增殖，但对其凋亡无明显影响。
【关键词】：博来霉素 肺纤维化 螺内酯 盐皮质激素受体 RNA干扰 小鼠巨噬细胞RAW264.7 增殖 凋亡
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R563.9
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-32
• 结果32-36
• 附图36-47
• 附表47-48
• 讨论48-50
• 结论50-51
• 参考文献51-56
• 综述 盐皮质激素受体与特发性肺纤维化56-69
• 参考文献61-69
• 致谢69-70
• 个人简历70

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 石晶;梁伟;陈铖;贾俊亚;丁国华;;醛固酮灌注诱导大鼠肾小球损伤[J];武汉大学学报(医学版);2008年02期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 周定;SHRs醛固酮水平对肾脏纤维化与CD2AP的影响和依普利酮的作用[D];天津医科大学;2009年

2 万琳媛;超声评价动脉粥样硬化性下肢动脉疾病患者外周动脉及左室改变[D];华中科技大学;2012年

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本文编号：330901