LPS/LBP复合物与CD14结合位点噬菌体克隆的筛选
发布时间：2021-08-17 09:43
脂多糖（LPS）,是革兰氏阴性细菌外壁的主要成分,可致内毒素性急性呼吸窘迫综合征,目前尚无理想的抗内毒素治疗药物。正常情况时人体内LPS的水平很低,即使在革兰阴性菌脓毒血症时,血浆中LPS浓度仅为0.011ng/ml[1]。LPS发挥致炎作需要LBP/CD14的增敏效应。脂多糖结合蛋白是脂多糖的结合蛋白,能将LPS单体转运至脂蛋白后通过肝脏从体内清除,并可以将LPS递呈给位于单核巨噬细胞及中性粒细胞表面的受体CD14,形成LPS/LBP/CD14三联复合物,启动LPS炎症信号通路,诱发级联炎症效应,导致内毒素性急性呼吸窘迫综合征。LPS/LBP复合物与CD14结合是启动LPS炎症信号通路的关键点,寻找LPS/LBP复合物与CD14的结合位点模拟肽,可以早期阻断LPS炎症信号通路。因此,本研究拟构建LPS/LBP复合物,并以LPS/LBP复合物为底物进行噬菌体十二肽库筛选,获得与LPS/LBP复合物具有较高亲和力,并与CD14竞争结合LPS/LBP复合物的噬菌体克隆。拟通过后续DNA测序后获得LPS/LBP复合物与CD14的结合位点的模拟肽,为进一步研究内毒性急性呼...
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
LPS/LBP复合物、LBP和LPS的凝胶显像结果
图 3-1 LPS/LBP 复合物凝胶电泳结果体亲和筛选和筛选是用 LPS/LBP 复合物包被酶标版，得到与 LPS/LBP 复合物高亲。图 3-2 显示每轮蓝斑测定滴度情况，表格二的显示每轮的噬菌体的产,得到与 LPS/LBP 高亲和力的噬菌体克隆,后 2 轮采用 CD14 竞争性洗脱争性结合 LPS/LBP 复合物的噬菌体克隆。比较 4 轮淘选的噬菌体回收率选所得的噬菌体回收率逐步提高。经 4 轮筛选,回收率从 2.35x10-6增加菌体得到了有效的富集。表 2 各轮筛选的滴度测定及富集情况次数 筛选前滴度 (pfu) 筛选前滴度 (pfu) 回收率(%) 4.0x10109.40x1052.35x10-6
C D图 3-2 每轮蓝白斑测定滴度的拍照结果A: 1-R 的滴度检测结果 B:2-R 的滴度检测结果C:3-R 的滴度检测结果 D:4-R 的滴度检测结果3.2.3 ELISA 检测结合活性第一次结合活性实验：经过四轮筛选后，ELISA 法检测噬菌体克隆与 LPS/LBP 复合物的结合活性，随机挑取 47 个单克隆，经化学发光检测，有 42 个单克隆发光检测为阳性（阴性对照 OD 为 0.076），结果显示 12 个噬菌体克隆所展示的多肽与 CD14 有较高亲和力，OD450 高于对照组 2 倍以上，其中 6、9、13、16、23、25、29、37、43、46 这 10 个噬菌体克隆 OD450 高于对照组 3 倍以上，阴性对照未显色。如表 3，表 4，图 3-3-1。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Phage display: development of nanocarriers for targeted drug delivery to the brain[J]. Babak Bakhshinejad,Marzieh Karimi,Mohammad Khalaj-Kondori. Neural Regeneration Research. 2015(06)
[2]抗CD14单克隆抗体对脓毒症急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞内NF-κB（p65）影响的研究[J]. 侯林义,张紫琦,张继峰,姜琴,吕洁萍,张文凯. 中华临床医师杂志(电子版). 2015(11)
[3]Bacteriophages and their applications in the diagnosis and treatment of hepatitis B virus infection[J]. Babak Bakhshinejad,Majid Sadeghizadeh. World Journal of Gastroenterology. 2014(33)
[4]三条脂多糖结合蛋白/CD14结合位点模拟肽体外抗内毒素活性的比较研究[J]. 徐智,李琦,冯起甲,钱桂生,徐顺贵,李昆霖,王兴胜,吴国明. 中国呼吸与危重监护杂志. 2008(06)
[5]脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的初步筛选[J]. 冯起甲,徐智,吴国明,徐顺贵,李树钧,陈维中,郭芮伶. 第三军医大学学报. 2007(16)
[6]脂多糖结合蛋白抗体对内毒素诱导的肺Ⅱ型细胞NF-κB活化的影响[J]. 李永旺,张德明,毛宝龄,钱桂生. 重庆医学. 2004(11)
本文编号：3347537
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
LPS/LBP复合物、LBP和LPS的凝胶显像结果
图 3-1 LPS/LBP 复合物凝胶电泳结果体亲和筛选和筛选是用 LPS/LBP 复合物包被酶标版，得到与 LPS/LBP 复合物高亲。图 3-2 显示每轮蓝斑测定滴度情况，表格二的显示每轮的噬菌体的产,得到与 LPS/LBP 高亲和力的噬菌体克隆,后 2 轮采用 CD14 竞争性洗脱争性结合 LPS/LBP 复合物的噬菌体克隆。比较 4 轮淘选的噬菌体回收率选所得的噬菌体回收率逐步提高。经 4 轮筛选,回收率从 2.35x10-6增加菌体得到了有效的富集。表 2 各轮筛选的滴度测定及富集情况次数 筛选前滴度 (pfu) 筛选前滴度 (pfu) 回收率(%) 4.0x10109.40x1052.35x10-6
C D图 3-2 每轮蓝白斑测定滴度的拍照结果A: 1-R 的滴度检测结果 B:2-R 的滴度检测结果C:3-R 的滴度检测结果 D:4-R 的滴度检测结果3.2.3 ELISA 检测结合活性第一次结合活性实验：经过四轮筛选后，ELISA 法检测噬菌体克隆与 LPS/LBP 复合物的结合活性，随机挑取 47 个单克隆，经化学发光检测，有 42 个单克隆发光检测为阳性（阴性对照 OD 为 0.076），结果显示 12 个噬菌体克隆所展示的多肽与 CD14 有较高亲和力，OD450 高于对照组 2 倍以上，其中 6、9、13、16、23、25、29、37、43、46 这 10 个噬菌体克隆 OD450 高于对照组 3 倍以上，阴性对照未显色。如表 3，表 4，图 3-3-1。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Phage display: development of nanocarriers for targeted drug delivery to the brain[J]. Babak Bakhshinejad,Marzieh Karimi,Mohammad Khalaj-Kondori. Neural Regeneration Research. 2015(06)
[2]抗CD14单克隆抗体对脓毒症急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞内NF-κB（p65）影响的研究[J]. 侯林义,张紫琦,张继峰,姜琴,吕洁萍,张文凯. 中华临床医师杂志(电子版). 2015(11)
[3]Bacteriophages and their applications in the diagnosis and treatment of hepatitis B virus infection[J]. Babak Bakhshinejad,Majid Sadeghizadeh. World Journal of Gastroenterology. 2014(33)
[4]三条脂多糖结合蛋白/CD14结合位点模拟肽体外抗内毒素活性的比较研究[J]. 徐智,李琦,冯起甲,钱桂生,徐顺贵,李昆霖,王兴胜,吴国明. 中国呼吸与危重监护杂志. 2008(06)
[5]脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的初步筛选[J]. 冯起甲,徐智,吴国明,徐顺贵,李树钧,陈维中,郭芮伶. 第三军医大学学报. 2007(16)
[6]脂多糖结合蛋白抗体对内毒素诱导的肺Ⅱ型细胞NF-κB活化的影响[J]. 李永旺,张德明,毛宝龄,钱桂生. 重庆医学. 2004(11)
本文编号：3347537
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