自噬的调控对大鼠矽肺纤维化影响的研究

发布时间：2017-04-30 12:18

  本文关键词：自噬的调控对大鼠矽肺纤维化影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的1本研究通过3-甲基腺嘌呤抑制自噬和雷帕霉素诱导自噬活动,观察染尘不同时间大鼠肺组织HE染色和Masson染色,同时对肺组织中胶原纤维面积的测定和血清中细胞因子含量的测定,分析各阶段矽肺纤维化发生发展过程。2通过电镜切片和肺组织内蛋白水平的表达,观察肺巨噬细胞(Alveolar macrophage,AM)自噬活动的强弱,分析细胞自噬与矽肺纤维化的关系。3纯化细胞灌洗液中的肺巨噬细胞,测其早期凋亡率,分析细胞自噬与细胞凋亡两者的联系。方法120只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为三组:模型组、三甲基腺嘌呤组(3-methlyadenine,3-MA)组和雷帕霉素组,每组均为40只。各组大鼠按照支气管灌注的方式进行矽肺常规造模。每组大鼠均在染尘第7天、14天、28天、60天和90天分别处死8只,收集左侧肺组织灌洗液,提取肺巨噬细胞,运用流式细胞仪检测肺巨噬细胞早期凋亡率;心脏取血,离心获取血清,使用酶联免疫法测定血清中细胞因子TNF-ɑ、TGF-β和IL-10的含量,观察肺纤维化的发展进程;取100mg左右的左侧肺组织,实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析Ⅰ型和Ⅲ型前胶原m RNA表达水平;取适量肺组织匀浆、组织裂解液裂解后,运用免疫印迹法测定肺组织内LC3、Beclin1、AKT和PDK1的蛋白表达水平;取120mg左右的肺组织,按照试剂盒说明测定其羟脯氨酸含量;将黄豆粒大小的右侧肺组织放入多聚甲醛溶液,行肺组织的HE染色和Masson染色,观察各实验组大鼠肺组织的病理变化情况和组织内胶原纤维的变化情况,并运用IPP(Image Pro Plus)图像分析软件测定胶原纤维的面积;取粟粒大小肺组织经2.5%的戊二醛溶液固定,制作电镜切片,观察肺巨噬细胞自噬活动的强弱程度。结果1各实验组大鼠肺组织HE染色:模型组大鼠肺组织内有炎性细胞浸润,肺泡壁明显增厚,肺泡腔减小,肺组织中成纤维细胞增多,随着染尘时间肺组织内出现大量的细胞结节和典型的矽结节;3-MA组大鼠在染尘早期肺组织的炎症反应不明显,但肺组织内仍有少量的炎性细胞浸润,在染尘后期大鼠肺组织内有细胞结节但没有明显的矽结节;雷帕霉素组大鼠在染尘初期的炎性反应程度比模型组严重,染尘中期出现大量的成纤维细胞,并且有典型的矽结节,染尘后期肺组织纤维化程度严重,肺组织被完全破坏。2各实验组大鼠肺组织Masson染色:Masson染色观察肺组织中胶原纤维的变化情况,运用形态学定量分析系统对胶原面积测定,发现模型组大鼠胶原纤维面积随着染尘时间呈现上升趋势;3-MA组大鼠胶原纤维面积在7天和14天增加,28天和60天胶原纤维面积与7天、14天比较,有减少的趋势,90天时胶原面积再次升高。3-MA组与模型组各时期相比,胶原纤维面积均比模型组低;雷帕霉素组不同时期胶原面积在不断增加,与模型组比较,胶原面积比模型组多,两个实验组与模型组比较均有统计学差异(P0.05)。各组羟脯氨酸的变化趋势与本组胶原纤维面积的变化趋势是相一致的。3不同处理组不同时期大鼠肺组织细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原m RNA测定:染尘后模型组7天Ⅰ型胶原m RNA比较高,14天和28天Ⅰ型胶原m RNA降低,60天和90天Ⅰ型胶原m RNA再次升高;3-MA组Ⅰ型胶原m RNA变化趋势基本与模型组一致,只7天3-MA组Ⅰ型胶原m RNA比模型组高,其他时期均比模型组低;雷帕霉素组Ⅰ型胶原m RNA呈现升高-降低循环出现的变化趋势,只染尘60天Ⅰ型胶原m RNA比模型组低,其他各时期均比模型组高。模型组Ⅲ型前胶原m RNA只染尘28天降低,其他各时期呈现升高趋势;3-MA组在给药初期Ⅲ型前胶原m RNA比较高,给药期14天和28天以及停药后60天的Ⅲ型前胶原m RNA呈现下降趋势,停药后90天的Ⅲ型前胶原m RNA再次升高,且3-MA组各时期Ⅲ型前胶原m RNA均比模型组低;雷帕霉素Ⅲ型前胶原m RNA的变化情况与本组Ⅰ型胶原m RNA的变化趋势相一致,只7天和28天Ⅲ型前胶原m RNA比模型组高,其他各时期均比模型组低,两组Ⅰ、Ⅲ型前胶原m RNA与模型组比较,差异有统计学意义(P0.05)。4各组血清中细胞因子含量的变化情况:模型组中细胞因子TNF-a含量随着染尘时间呈上升趋势;3-MA组细胞因子TNF-a含量在给药第7天比较低,14天时含量增加,28天及停药60天时含量降低,90天时含量再次升高,但各时期细胞因子含量均比模型组低;雷帕霉素组在给药时期含量呈现上升趋势,停药后的60天含量明显下降,90天时再次升高。各组TGF-β含量的变化趋势与本组TNF-a相一致。而三组肺组织内IL-10含量随着染尘时间均呈现上升趋势,雷帕霉素组各时期比模型组低,3-MA组各时期比模型组高。5各组大鼠肺巨噬细胞不同时期自噬活动:电镜观察发现不同处理组不同时期自噬活动强弱不同。模型组大鼠在染尘早期出现自噬前体和自噬溶酶体,染尘中期出现自噬体,染尘后期自噬体逐渐消失,3-MA组大鼠肺巨噬细胞中的自噬体比模型组数量少而雷帕霉素组自噬体的数量明显比模型组多。为了进一步说明自噬活动的强弱,我们测定了自噬的的标志蛋白LC3和Beclin1,发现7天时3-MA组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值比模型组高但比雷帕霉素组低;而在14天和28天3-MA组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低且比模型组和雷帕霉素组低;停药后3-MA组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值再次增高且60天时比模型组高,90天三个实验组组数据差异没有统计学意义;雷帕霉素组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值呈升高趋势,且雷帕霉素组各个时期的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均比模型组高。各组Beclin1的蛋白表达与本组LC3的变化趋势一致。6各组大鼠肺组织内蛋白表达水平分析:本文通过western blotting的方法测定AKT和PDK1蛋白在肺组织中的表达水平,表示大鼠肺纤维化程度。实验结果显示模型组大鼠肺组织随着染尘时间AKT蛋白含量呈现上升趋势;3-MA组和雷帕霉素组大鼠肺组织中AKT蛋白含量随着染尘时间同样呈现上升趋势,所不同的是3-MA组各个时期蛋白含量均比模型组低而雷帕霉素组各时期蛋白含量均比模型组高,且两组与模型组的比较均有统计学差异。7肺巨噬细胞早期凋亡率测定:雷帕霉素组大鼠染尘不同时间LC3蛋白表达均增加且比模型组高;肺巨噬细胞早期凋亡率分别为(1.74±0.73)、(1.25±0.35)、(1.44±1.24)、(3.70±1.51)、(36.98±11.91)与模型组(5.63±1.01)、(4.95±0.63)、(4.10±0.43)、(6.75±4.19)、(30.23±11.05)相比,除90天外均比模型组低(P0.05);而3-MA组肺巨噬细胞的早期凋亡率分别为(2.86±1.13)、(8.80±0.28)、(6.84±1.29)、(2.54±1.65)、(37.22±16.22),7天时凋亡率低于其他时期;14天和28天时凋亡率增加且比同时期模型组高(P0.05);60天时凋亡率再次降低;90天凋亡率时与模型组无明显差异。结论1雷帕霉素通过诱导自噬活动,导致染尘大鼠肺组织纤维化程度加重,且受自噬的调控,蛋白AKT、PDK1随着染尘时间呈现上升趋势。2 3-MA通过抑制自噬活动,导致染尘大鼠肺组织纤维化程度减轻,蛋白AKT、PDK1随着染尘时间也呈现上升趋势,但含量均比正常矽肺模型组大鼠的含量低。3雷帕霉素和3-MA诱导和抑制自噬活动后,在染尘初期,大鼠细胞早期凋亡率随着自噬活动的增强而降低,但在染尘后期,细胞早期凋亡率随着自噬活动增强也呈现升高的趋势。
【关键词】：肺巨噬细胞 自噬 肺纤维化 3-甲基腺嘌呤 雷帕霉素
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R135.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 引言15-17
• 第1章 实验研究17-48
• 1.1 实验动物17
• 1.1.1 动物分组17
• 1.1.2 矽肺造模17
• 1.1.3 药物干预17
• 1.2 实验试剂与仪器17-22
• 1.2.1 主要仪器17-19
• 1.2.2 主要试剂19-21
• 1.2.3 主要试剂配制21-22
• 1.3 研究内容22
• 1.4 实验方法22-28
• 1.4.1 肺组织的病理观察22
• 1.4.2 肺组织Masson染色22-23
• 1.4.3 电镜观察23
• 1.4.4 Real-time PCR法检测Ⅰ型和Ⅲ型前胶原23-24
• 1.4.5 肺组织纤维化和自噬相关蛋白含量测定24-27
• 1.4.6 羟脯氨酸含量测定27
• 1.4.7 细胞因子测定27-28
• 1.4.8 肺巨噬细胞早期凋亡率测定28
• 1.5 统计分析28
• 1.6 质量控制28
• 1.7 结果28-39
• 1.7.1 大鼠肺组织纤维化程度的变化29-34
• 1.7.2 大鼠肺组织肺巨噬细胞自噬活动34-36
• 1.7.3 肺巨噬细胞早期凋亡水平36-38
• 1.7.4 调控自噬相关蛋白表达38-39
• 1.8 讨论39-43
• 1.9 小结43-44
• 参考文献44-48
• 第2章 综述48-57
• 2.1 自噬48-50
• 2.1.1 自噬的基本概念48
• 2.1.2 自噬的形态特征48-49
• 2.1.3 自噬的分类49
• 2.1.4 自噬的发生机制49-50
• 2.1.5 自噬的生物学功能50
• 2.2 自噬的研究现状50-52
• 2.2.1 自噬与肺部疾病50-51
• 2.2.2 自噬与其他疾病51-52
• 2.3 结语52
• 参考文献52-57
• 结论57-58
• 致谢58-59
• 导师简介59-60
• 作者简介60-61
• 学位论文数据集61

【参考文献】

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1 王耀勇,徐启勇,叶燕青,叶旭军,龙翔;IL-10在博莱霉素诱导大鼠所致肺纤维化中的作用[J];武汉大学学报(医学版);2004年02期

  本文关键词：自噬的调控对大鼠矽肺纤维化影响的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：336857