人羊膜上皮细胞冻存前后生物学特性比较及其对脂多糖致肺损伤干预作用的研究

发布时间：2017-05-12 22:08

  本文关键词：人羊膜上皮细胞冻存前后生物学特性比较及其对脂多糖致肺损伤干预作用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 1、液氮深低温保存人羊膜上皮细胞（human Amniotic Epithelial Cells，hAECs）是否会对其干细胞活性产生影响，相关报道较少见。本研究从细胞形态学、细胞生长状况、细胞表面干细胞标志物及干细胞基因表达、细胞体外成骨细胞、成脂肪细胞多向诱导分化四个方面，来观察hAECs冻存前后的生物学活性和干细胞特性，以研究液氮深低温保存hAECs的可靠性。 2、脓毒血症仍然是导致急性肺损伤（acute lung injury，ALI）最常见的原因，目前尚缺乏十分有效的治疗手段。本研究通过检测肺组织病理学切片、肺组织和血清中细胞因子的变化，来观察hAECs对内毒素性肺损伤的干预作用及其可能机制，以探讨人羊膜上皮细胞治疗急性肺损伤的可行性。 方法： 1、取健康产妇足月剖宫产后胎盘的羊膜组织，采用多次胰酶消化法获取hAECs，培养过程中经多次差别消化法逐步纯化hAECs。调整纯化的第2代（P2）细胞密度至5×106/mL，向细胞中缓慢加入新鲜配制的二甲基亚砜（DMSO）冻存液。将冻存管置于程序降温仪中，待温度降至-100℃后迅速移入液氮罐中保存。1个月后对细胞进行复苏培养，观察冻存前后hAECs的形态变化及增殖情况；并用流式细胞分析仪检测细胞表面标记物（CD29、CD73、CD166、CD44、CD90、HLA-ABC、CD34）；用RT-PCR法检测Oct-4及Nanog干细胞基因表达；同时在体外诱导hAECs向脂肪细胞、成骨细胞分化。数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量数据资料以均数±标准差（x s）表示，采用独立样本t检验法分析两组间的差异。 2、向新生SD大鼠腹腔内注射大肠杆菌内毒素溶液20μL/g(5mg/kg)，制备脂多糖致急性肺损伤的动物模型。造模后2h经气管滴入CM-Dil荧光标记好的P2代hAECs。动物随机分组如下：（A）正常组（n=5）；（B）模型组（LPS）（n=5）：腹腔内注射LPS5mg/kg；（C）细胞组（n=5）：腹腔内注射LPS5mg/kg+气管内滴注hAECs（5×105个cells/40μL）；（D）对照组（n=5）：腹腔内注射LPS5mg/kg+气管内滴注40μLPBS液。分别在输注细胞24h、72h后，处死动物收取标本，每组每个时间点各5只大鼠。取肺组织标本固定，HE染色后观察肺损伤程度，测量肺损伤病理评分、肺泡间隔的厚度，测量肺干湿比（D/W）。用ELISA免疫吸附法检测肺组织丙二醛（MDA）浓度和超氧化物歧化酶（SOD）活性、同时检测血清中白介素10（IL-10）和白介素6（IL-6）的浓度。数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量数据资料以均数±标准差（x s）表示，用单因素方差分析法分析组间差异。 结果： 1、hAECs冻存前后的形态学无明显改变，均呈铺路石样膜状生长。与冻存前细胞相比，冻存后hAECs传代时所需的消化时间有所缩短（P0.05），但细胞活率、传代时间、培养代数无明显改变。冻存前后细胞生长曲线均呈S型，冻存后细胞与冻存前细胞的生长周期相比，细胞经历滞留期、对数期和平台期的时间无明显差异。 2、冻存后hAECs仍可以表达干细胞表面标记，CD73、CD29、CD166阳性率达90%以上，中度表达CD90、CD44，低表达I类白细胞抗原(HLA-ABC)，不表达造血干细胞标志CD34。RT-PCR法检测Oct-4及Nanog基因表达均呈阳性。体外诱导后，冻存前后的hAECs均可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。 3、腹腔内注射LPS后，肺组织可见不同程度充血、血管内皮损伤出血，部分肺泡萎陷不张，部分肺泡间隔增厚、破坏。模型组与正常组相比，肺损伤病理评分、肺泡间隔的厚度均有显著增加（P0.01）、肺干湿比减低（P=0.04）。检测肺组织和血清中的生化指标发现， MDA浓度有所升高伴SOD活性减低，模型组与正常组比较，两者的变化都尚未达到统计学意义（P0.05）。模型组血清中促炎症因子IL-6水平逐渐升高，抗炎因子IL-10的水平逐渐减低，与正常组相比，IL-6水平24h为1.25±0.01（P=0.762），72h为1.61±0.29（P=0.006）；IL-10的水平24h为13.68±1.14（P=0.219），72h为12.49±0.40（P=0.005），两种因子在血清中的浓度变化72h时差别具有统计学意义。 4、输入hAECs细胞后，细胞组与对照组相比，24h和72h时肺损伤评分、肺泡间隔厚度均有显著降低（P0.01），差别具有统计学意义。细胞组中肺干湿比（D/W值）与对照组相比有所升高，24h时P=0.046，差异具有统计学意义，72h时P=0.366差异无明显统计学意义。细胞组氧化因子MDA的浓度在肺组织中逐渐减低，抗氧化因子SOD活性逐渐升高，与对照组对比，差别具有统计学意义。细胞组中促炎症因子IL-6水平降低，抗炎因子IL-10水平升高，与对照组相比72h时P0.05，差异具有统计学意义。 结论： 1、冻存后的hAECs除细胞贴壁性有所下降外，细胞形态、细胞生长周期、细胞表面干细胞标记及其多向分化的潜能均没有改变，说明液氮深低温保存不影响hAECs的生物学特性，可以成为保存hAECs的一个可靠方法。 2、气管内输入hAECs后，肺组织损伤评分减少、肺泡间隔的厚度缩小，肺水肿减轻，说明可以hAECs可以减少炎性细胞的浸润，减轻肺泡渗出，对内毒素导致的ALI具有修复作用。 3、hAECs能够通过减轻局部氧化应激反应，调节促炎因子和抗炎因子的平衡，减轻炎症反应，保护受损组织，促进组织恢复
【关键词】：羊膜上皮细胞 多能性 深低温保存 脂多糖 急性肺损伤
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563
【目录】：

• 主要符号表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-17
• 第一部分 人羊膜上皮细胞冻存前后生物学特性的比较17-30
• 材料及方法17-23
• 1 实验材料17-19
• 1.1 主要实验器材17
• 1.2 主要实验仪器17-18
• 1.3 主要实验试剂18-19
• 1.4 实验试剂浓度的配制19
• 2 实验方法19-23
• 2.1 人羊膜上皮细胞的收集、培养19-20
• 2.2 人羊膜上皮细胞的传代培养20
• 2.3 人羊膜上皮细胞的冻存20
• 2.4 人羊膜上皮细胞的复苏20-21
• 2.5 细胞增殖动力学分析21
• 2.6 流式细胞学检测细胞表面标志物21
• 2.7 人羊膜上皮细胞的鉴定21
• 2.8 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测干细胞相关基因表达21-23
• 2.9 向成脂肪细胞诱导分化23
• 2.10 向成骨细胞诱导分化23
• 结果23-27
• 1 人羊膜上皮细胞冻存前后的培养及扩增23-25
• 2 人羊膜上皮细胞冻存前后生物学性状分析25-27
• 讨论27-30
• 第二部分 人羊膜上皮细胞对脂多糖致肺损伤的干预研究30-41
• 材料及方法30-35
• 1 实验材料30-31
• 2 实验方法31-35
• 3 统计学处理35
• 结果35-38
• 1 人羊膜上皮细胞在肺内的情况35
• 2 评价细胞输入前后肺组织炎症程度35-37
• 3 细胞输入后肺组织中细胞因子水平检测37
• 4 细胞输入后血清中细胞因子水平检测37-38
• 讨论38-41
• 总结41-42
• 附图42-49
• 参考文献49-54
• 综述54-64
• 参考文献60-64
• 攻读学位期间取得的研究成果64-65
• 致谢65-66

【参考文献】

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1 黄友章;沈建良;宫立众;郑培浩;刘毅;尹文杰;岑坚;王宁;赵德峰;;骨髓细胞液氮保存21-25年后的细胞活力体外研究[J];中国实验血液学杂志;2010年01期

  本文关键词：人羊膜上皮细胞冻存前后生物学特性比较及其对脂多糖致肺损伤干预作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：360956