TOLL样受体4在小鼠肺部衣原体感染过程中作用的研究

发布时间：2017-05-12 22:05

  本文关键词：TOLL样受体4在小鼠肺部衣原体感染过程中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, C. trachomatis)所引起的疾病是当前全世界严重公共卫生问题之一,但是其感染的免疫机制仍然没有阐明。Toll样受体4作为被人类首个发现的哺乳动物体内的Toll样蛋白,是Toll样受体家族最重要的蛋白之一,人们对TLR4的研究大多是关注其在先天免疫方面所发挥的作用。但是在衣原体感染过程中Toll样受体4所发挥的作用却尚不清楚。本研究拟在建立沙眼衣原体肺部呼吸道感染模型的基础上,对沙眼衣原体在C3H/HeN小鼠,C3H/HeJ小鼠(TLR4基因位点突变)肺感染过程中肺部衣原体载量,肺部炎症反应,体重变化,存活率等各个方面进行研究,以及免疫机制的初步探讨,结果如下： 1.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠巨噬细胞体外刺激实验研究。显示C3H/HeN小鼠巨噬细胞由于Toll样受体4通路完整产生了更多的促炎症细胞因子TL-6。 2.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原体之后体重变化的研究。取6-8周龄的C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠,滴鼻感染5×103IFU的沙眼衣原体鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum, Cm)。监测两种不同小鼠在感染后不同天数的体重变化,发现C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原体后体重下降幅度明显大于正常小鼠,并且只有极少数C3H/HeJ小鼠能恢复至正常体重。 3.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原体之后存活率研究。发现C3H/HeN小鼠在感染相同量衣原体之后存活率显著高于基因突变小鼠,并且大部分C3H/HeN小鼠能在感染后第10天开始逐渐恢复健康。 4.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原体之后肺部衣原体载量的研究。结果显示C3H/HeJ小鼠含有更高载量的衣原体,并且正常小鼠衣原体在感染后第12天出现下降趋势。 5.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原体之后肺组织病理变化的研究。通过小鼠肺组织HE染色显示,两种不同小鼠在感染衣原体之后相同时间,C3H/HeJ小鼠出现了更加严重的炎症浸润。 6.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原体之后肺组织中髓过氧化物酶(MPO)的研究。通过化学发光免疫分析法结果显示,Toll样受体4基因突变小鼠在感染沙眼衣原体之后的第3天和第7天肺组织中显著的嗜中性粒细胞的渗透。 7.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原体之后肺泡灌洗液中性粒细胞研究。实验结果表明,Toll样受体4基因突变小鼠在感染后第3天和第7天肺泡灌洗液中都含有更高的中性粒细胞百分比,在感染后第7天尤其显著。 8.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原体之后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)动态变化研究。实验结果显示,两种不同小鼠在感染沙眼衣原体后Treg细胞所占百分比没有显著变化,但是C3H/HeJ小鼠Treg细胞的绝对细胞数却在第3天显著下降。 9.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠Th-1免疫反应的研究。结果两种小鼠IFN-γ蛋白水平在感染之后各天也没有显著差异,说明两种不同小鼠在感染沙眼衣原体后Th-1免疫反应并没有起关键作用。 10.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠Th-2免疫反应的研究。结果显示两种小鼠感染沙眼衣原体之后Th-2免疫反应并没有差异。 11.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠IL-17/Th-17免疫反应的研究。通过RT-PCR的方法检测两种小鼠肺组织中IL-6mRNA, IL-17mRNA水平的表达,通过流式细胞仪检测脾脏CD4+CD44+IL-17+在淋巴细胞所占比重,以及CD4+CD44+IL-17+的平均荧光强度(MFI),最后进一步通过ELISA方法检测IL-17在两种不同小鼠蛋白质水平的表达情况。实验结果显示,Toll样受体4基因突变小鼠IL-6mRNA, IL-17mRNA水平,CD4+CD44+IL-17+在淋巴细胞所占比重以及CD4+CD44+IL-17+的平均荧光强度都低于正常小鼠,并且蛋白水平同样低于正常小鼠。说明了IL-17/Th-17的免疫反应需要TLR4信号通路。 12.C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠在感染沙眼衣原体之后Th-17相关趋化因子表达研究。通过RT-PCR的方法检测两种小鼠肺组织中KC, MIP-2mRNA水平的表达。结果显示,C3H/HeN小鼠KC的mRNA的表达水平在感染之后第3天显著高于C3H/HeJ小鼠,并且C3H/HeN小鼠的MIP-2mRNA的表达水平在感染之后第7天也高于C3H/HeJ小鼠,说明IL-17下游的的炎症相关趋化因子的表达趋势与IL-17/Th-17免疫反应趋势基本吻合。 综上所述：C3H/HeN小鼠和C3H/HeJ小鼠在肺部感染沙眼衣原体之后,Toll样受体4基因突变小鼠体重下降显著,存活率低,并且肺组织中衣原体载量显著高于正常小鼠,肺部出现严重的炎症反应,大量中性粒细胞渗透肺组织和肺泡中,并且尽管CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在所占百分比未变化的前提下,绝对细胞数发生了显著的降低,同时Toll样受体4基因突变抑制小鼠IL-17/Th-17反应的免疫应答,但是并没有抑制小鼠Th-1免疫反应和Th-2免疫反应。揭示了TLR4在小鼠感染沙眼衣原体时发挥着保护的作用,并且与IL-17/Th-17免疫应答受到抑制密切相关。
【关键词】：沙眼衣原体鼠肺炎菌株 C3H/HeJ小鼠 CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞 IL-17/Th-17
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.1
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 缩略语表12-13
• 1 前言13-21
• 1.1 衣原体13-14
• 1.2 Toll样受体家族14-17
• 1.2.1 Toll样受体家族种类与分布14-15
• 1.2.2 Toll样受体功能15-16
• 1.2.3 TLR4的功能16-17
• 1.3 T细胞的分类17-20
• 1.3.1 调节性T细胞的功能17-18
• 1.3.2 Th17细胞的功能18-20
• 1.4 研究目的与意义20-21
• 2 材料与方法21-35
• 2.1 材料21-24
• 2.1.1 实验动物与菌株21
• 2.1.2 主要试剂和仪器21-23
• 2.1.3 溶液配制23-24
• 2.1.3.1 ELISA相关溶液23-24
• 2.1.3.2 衣原体培养及感染相关溶液24
• 2.2 实验方法24-35
• 2.2.1 Chlamydia Muridarum培养、纯化及滴度测定24-27
• 2.2.1.1 Chlamydia Muridarum培养24-25
• 2.2.1.2 Chlamydia Muridarum收集25
• 2.2.1.3 复方泛影葡胺密度梯度离心法纯化Chlamydia Muridarum25-26
• 2.2.1.4 Chlamydia Muridarum EB滴度的测定(免疫荧光法定量)26-27
• 2.2.2 沙眼衣原体小鼠感染模型的建立和检测指标27-35
• 2.2.2.1 小鼠沙眼衣原体肺炎模型的建立27
• 2.2.2.2 肺组织中IFU的检测27-28
• 2.2.2.3 TRIzol法提取肺组织RNA28-29
• 2.2.2.4 逆转录总RNA为cDNA29-30
• 2.2.2.5 Real-time quantitative PCR30
• 2.2.2.6 肺组织中MPO的检测30
• 2.2.2.7 脾细胞和纵膈淋巴结细胞的分离30-31
• 2.2.2.8 流式细胞术检测CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞的表达31-32
• 2.2.2.9 流式细胞术检测IL-17+T细胞的表达32
• 2.2.2.10 流式细胞术检测肺泡灌洗液中中性粒细胞的表达32-33
• 2.2.2.11 流式细胞术检测IFN-γ+T细胞的表达33
• 2.2.2.12 ELISA检测肺组织匀浆上清液中IL-6、IL-17和IL-4、IL-5、IFN-γ浓度33-34
• 2.2.2.13 肺组织病理学染色34
• 2.2.2.14 统计学方法34-35
• 3 结果与分析35-47
• 3.1 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠巨噬细胞刺激实验35
• 3.2 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠感染衣原体后的体重变化35-36
• 3.3 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠感染衣原体后的存活率变化36-37
• 3.4 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠感染后衣原体载量的差异37-38
• 3.5 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠衣原体感染后的免疫病理损伤38-39
• 3.6 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠感染衣原体肺组织中MPO的水平39-40
• 3.7 C3H/HeN, C3H/HeJ小鼠感染衣原体肺泡灌洗液中粒细胞差异40-41
• 3.8 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠感染衣原体后Treg动态变化41-42
• 3.9 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠感染衣原体后Th-1免疫反应42-43
• 3.10 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠感染衣原体后Th-2免疫反应43-44
• 3.11 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠感染衣原体后IL-17/Th17反应44-45
• 3.12 C3H/HeN,C3H/HeJ小鼠感染衣原体Th17相关趋化因子表达45-47
• 4 讨论47-51
• 参考文献51-57
• 致谢57-58
• 附录58

【参考文献】

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1 李响,龚志勇,李虹,魏强,石明,杨宇如;卡介苗诱导膀胱癌T24细胞表达钟声蛋白样受体和产生细胞因子的研究[J];中华外科杂志;2004年03期

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本文编号：360942