短发夹RNA抑制人肺成纤维细胞TGF-β1基因表达的研究

发布时间：2022-06-02 21:00

　　目的观察三个针对人转化生长因子β1（TGF-β1）的小发夹RNA（shRNA）真核表达质粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3）对人肺成纤维细胞TGF-β1基因表达的抑制作用,并筛选出其中抑制效应最佳的质粒。观察抑制TGF-β1基因表达对人肺成纤维细胞生长的影响,并初步评价其应用的安全性,为进一步研究RNAi在肺纤维化基因治疗中的应用提供实验依据。方法将构建完成的三个针对人转化生长因子β1（TGF-β1）的小发夹RNA（shRNA）真核表达质粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3）和对应的阴性对照质粒（Control组、Control2组、Control3）进行酶切鉴定和DNA测序分析。在Lipofectamine2000介导下分别将上述质粒转染人肺成纤维细胞,分组命名为shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、Control组、Control2组、Control3组并设立未转染空白对照组。转染48h后应用实时荧光定量PCR检测人肺成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达水平和ELISA检测细胞上清液中TGF-β1蛋白质含量。转染48h后在光镜下观察各组细胞的形态学变化并... 

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【学位级别】：硕士

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缩略词
前言
第一部分 特异性人TGF-β1shRNA真核表达质粒的筛选
    材料与方法
        一、主要仪器与材料
            1.主要仪器及设备
            2.主要试剂、培养基及耗材
            3.菌株、细胞株及质粒
            4.常用试剂的配制方法
        二、技术路线
        三、实验方法
            1.检测各个重组质粒
            2.转染质粒的制备
            3.人肺成纤维细胞培养
            4.细胞转染
            5.实时荧光定量PCR检测TGF-β1的mRNA含量
            6.ELISA法测定细胞上清液中TGF-β1含量
    结果
        1.TGF-β1 shRNA真核表达质粒的鉴定
        2.人肺成纤维细胞形态特征
        3.实时荧光定量PCR定量测定TGF-β1 mRNA结果
        4.ELISA法测人肺成纤维细胞上清液TGF-β1蛋白的结果
    讨论
        一、基因治疗肺纤维化靶点的选择
            1.肺纤维化的流行病学概况及治疗现状
            2.肺纤维化病因学研究得到的线索
            3.基因靶向治疗肺纤维化的立论依据
        二、RNAi效应分析
            1.RNAi现象及RNAi技术
            2.RNAi技术的特点及应用
            3.实验结果讨论
        三、实验方法的讨论
            1.细胞株的选择
            2.转染方法的选择
            3.转染要点
            4.检测时间位点的选择
            5.RNA干扰效应的检测方法
    结论
第二部分 干扰TGF-β1表达后对人肺成纤维细胞生长影响
    一、人肺成纤维细胞各实验组形态学观察
        1.材料与仪器
        2.方法
        3.镜下观察结果
    二、台盼蓝染色检测细胞死亡数目
        1.材料与仪器
        2.方法
        3.台盼蓝染色计数结果
    三、讨论
    四、结论
参考文献
附录
综述
在校期间论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]阿魏酸钠对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子β1信号通路分子mRNA表达的影响[J]. 穆茂,程德云,杨礼腾,方询,聂莉,胡小波.  中国呼吸与危重监护杂志. 2007(02)
[2]转化生长因子-β1及其受体在肺纤维化中的作用[J]. 甘红英,刘学军.  国际呼吸杂志. 2006(11)
[3]转化生长因子-β与肺纤维化[J]. 任鹏,吴秀珍,赵静,王献华.  中国煤炭工业医学杂志. 2006(06)
[4]肺纤维化细胞因子机制研究进展[J]. 何燕,邓国忠,高天.  中华创伤杂志. 2006(06)
[5]细胞因子与肺纤维化[J]. 韦小瑜,何云,程明亮.  西南军医. 2006(02)
[6]RNA干扰对系统性硬化病皮肤成纤维细胞结缔组织生长因子表达的影响[J]. 肖嵘,罗婧莹,刘伏友,周英,李亚萍,周怡新,苏玉文,文海泉,杨心洁.  中华皮肤科杂志. 2006(01)
[7]短发夹RNA介导RNA干扰的时间和剂量效应研究[J]. 何国平,张思仲,王英成,肖翠英,马用信,许文明,丁兰,陶大昌,孙岩,陈玉娟.  生物化学与生物物理进展. 2005(03)
[8]损伤气道上皮组织转化在气道重塑中的作用[J]. 张敏,吴壮,徐军.  医学研究生学报. 2004(11)
[9]丹参对实验性肺纤维化小鼠病理变化和转化生长因子-β表达的影响[J]. 苗维纳,董静,刘绍唐,陈康.  中药药理与临床. 2003(05)
[10]Smad蛋白家族与TGF-β信号转导[J]. 杨力.  中国美容医学. 2001(06)



本文编号：3653082