细胞自噬在PM2.5诱导的气道炎症中的作用

发布时间：2017-05-21 12:15

  本文关键词：细胞自噬在PM2.5诱导的气道炎症中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：越来越多的研究发现,悬浮颗粒物(particulate matters,PM)是引起呼吸系统疾病、心血管疾病及癌症发病率上升和死亡率增加的重要因素之一。PM主要由工业生产过程高温产生或是生物燃料及矿物燃料燃烧所产生,通过沉积于气道或者进入肺泡,能引起或者加重多种肺部疾病。PM按空气动力学直径(AD)可分为粗颗粒物(AD2.5pμm)、细颗粒物(0.1μm≤AD≤2.5μm)和超细颗粒物(AD0.1μm)。PM2.5即AD≤2.5pμm的悬浮颗粒物。当颗粒物的粒径越小,表面积越大时,颗粒沉降速度越慢,传播距离越远,而且能携带更多的有毒有害物质,对人体健康的危害也越大。研究发现PM暴露可诱导气道高反应性,诱导中性粒细胞性气道炎症；可加重哮喘气道炎症,尤其是中性粒细胞性气道炎症,导致哮喘患者对激素治疗敏感性降低,还可通过上调细胞内氧化应激水平从而诱导气道上皮间质转化,亦可使哮喘患者更易发生气道重塑。 细胞自噬是细胞内物质循环的重要过程,以满足细胞代谢、细胞与组织更新、维持细胞稳态的需要。正常生理条件下,细胞内保持一个低的基础自噬水平,但是当细胞在营养能量缺乏、氧化应激、感染等情况下,自噬水平会迅速被上调。细胞自噬分3种类型,巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。通常说的细胞自噬即巨自噬。在细胞巨自噬过程中,来源于细胞膜、内质网、线粒体或高尔基体的双层膜结构可通过包裹可溶性蛋白及某些细胞器形成自噬体,继而与溶酶体融合形成自噬溶酶体,包裹物在溶酶体释放的大量酸性蛋白酶的作用下得以降解和循环再利用。越来越多的证据表明细胞自噬及与之相关的调节蛋白能够影响细胞内很多极其重要的生理过程如细胞增殖、程序性细胞死亡、炎症及细胞免疫功能等,因此在包括神经性疾病、心血管疾病、炎症性疾病和肿瘤等在内多种疾病的发生发展中起着重要作用。目前已有研究发现细胞自噬与呼吸系统疾病亦有关联。细胞自噬在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤、呼吸道感染、肺动脉高压、肺囊性纤维化、α1-胰蛋白酶缺陷、败血症中发挥重要作用。 另有研究证实PM暴露能够诱导气道上皮细胞自噬的发生,PM亦能够引起中性粒细胞增高为主的气道炎症,而细胞自噬能调控急慢性气道炎症,提示细胞自噬也可能参与调控PM引起的气道炎症,目前尚未对此有报道。本课题拟以空气动力学直径2.5μm的悬浮颗粒物PM2.5作为研究对象,研究细胞自噬在PM2.5诱导的气道炎症中的作用。 目的：体外研究利用细胞自噬相关基因siRNA和抑制剂,体内研究利用细胞自噬缺陷小鼠明确细胞自噬是否在PM2.5诱导的气道炎症中发挥作用。 方法：体外研究中,首先用PM2.5干预人气道上皮细胞HBE细胞,Western blot检测LC3B的表达,电镜观察自噬特征性结构来观察PM2.5是否能够诱导细胞自噬,利用GFP-LC3和1RFP-GFP-LC3转入细胞后免疫荧光方法检测进一步验证结果,同时观察PM2.5能否上调中性粒细胞趋化因子IL-8的表达。然后,利用自噬相关基因siRNA特异性敲除自噬相关基因,利用自噬抑制剂下调细胞自噬水平后,观察是否能够影响PM2.5上调IL_8的表达。 体内研究中,6-8周龄小鼠随机分成4组：WT/NS组、Beclin1+/-/NS、WT/PM2.5和Beclin1+/-/PM2.5组,WT/PM2.5和Beclin1+/-/PM2.5组PM2.5短期气道滴注构建小鼠气道炎症模型,WT/NS组、Beclin1+/-/NS组等量生理盐水气道滴注作为对照,观察各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数、分类细胞计数、病理学改变,采用ELISA方法检测BALF上清中小鼠中性粒细胞趋化因子KC和MIP-2的表达,Q-PCR检测肺组织匀浆中KC和MIP-2的表达。 结果：体外实验中,PM2.5100μg/ml干预24小时后,HBE细胞LC3B表达明显增加。在透射电镜下可见细胞内黑色颗粒物周围出现空泡状双层膜样结构,正在或者已经形成自噬体,并与溶酶体融合、消化,而对照组的细胞结构完整,细胞中未见损伤细胞器,亦未见有自噬泡的形成。将GFP-LC3质粒转入HBE细胞后,共聚焦显微镜下可观察到PM2.5干预组细胞质中可见多个明亮的绿色荧光斑点,将mRFP-GFP-LC3质粒转入细胞后,可观察到PM2.5干预组细胞质中可见很多明亮的红色和黄色荧光斑点,分别代表了自噬溶酶体和自噬体,进一步证实PM2.5能够诱导细胞自噬的发生。同时,也发现PM2.550μg/ml干预24小时后,NCI-H292细胞IL-8的表达显著升高,而用细胞自噬相关基因Atg5-siRNA、Atg12-siRNA和Belinl-siRNA及细胞自噬抑制剂下调细胞自噬水平时,PM2.5诱导的IL-8的表达明显减少。 体内实验中,利用PM2.5(2mg/ml连续气道滴注2天的方法构建小鼠气道炎症模型,通过对PM2.5干预组与NS干预组的对比发现,PM2.5干预组小鼠BALF中细胞总数和中性粒细胞数增加,肺组织及BALF上清中小鼠中性粒细胞的趋化因子KC和MIP-2的表达升高,肺组织病理学检查HE染色发现PM2.5组较NS组气道周围炎症细胞的浸润明显增加,提示PM2.5能够诱导小鼠气道炎症的发生。Beclinl+/-/PM2.5与WT/PM2.5组小鼠相比,BAFL中细胞总数和中性粒细胞数有明显减少,肺组织及BALF上清中中性粒细胞的趋化因子KC和MIP-2的表达亦下降,同时病理学检查发现气道周围炎症细胞的浸润也明显减少,提示Beclinl+/-小鼠对PM2.5诱导的气道炎症具有明显保护作用。 结论：体外体内实验证明细胞自噬在PM2.5诱导的气道上皮细胞中性粒细胞趋化因子的表达增加和气道炎症的发生中起恶化作用,为治疗PM2.5诱导的气道炎症提供治疗靶点。
【关键词】：PM2.5 细胞自噬 气道炎症 中性粒细胞 中性粒细胞趋化因子
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R562
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 缩略语中英文对照13-14
• 目次14-16
• 第一章 引言16-18
• 第二章 材料与方法18-34
• 2.1 PM18
• 2.2 实验动物18
• 2.3 使用的主要实验仪器与设备18-19
• 2.4 实验试剂与材料19-22
• 2.4.1 实验试剂与材料19-21
• 2.4.2 实验试剂配制21-22
• 2.5 实验方法22-34
• 2.5.1 细胞培养22
• 2.5.2 siRNA转染(按Genmute siRNA transfection reagent说明书要求)22-23
• 2.5.3 细胞总mRNA的提取及组织总mRNA的提取23-24
• 2.5.4 cDNA的合成及Q-PCR过程24-26
• 2.5.5 构建PM诱导的小鼠急性气道炎症模型26-27
• 2.5.6 动物处理及标本收集27
• 2.5.7 ELISA检测BALF上清中KC/MIP-2的表达(RD ELISA试剂盒)27-28
• 2.5.8 透射电镜样品的准备及处理28-29
• 2.5.9 Western Blot29-31
• 2.5.10 GFP-LC3和mRFP-GFP-LC转染及免疫荧光样品准备31-32
• 2.5.11 统计学分析32-34
• 第三章 研究结果34-48
• 3.1 PM能够诱导人气道上皮细胞细胞自噬的发生34-38
• 3.1.1 不同浓度、不同时间PM干预HBE细胞,可诱导LC3B表达增加34-35
• 3.1.2 透射电镜下观察PM能够诱导细胞自噬体形成35-36
• 3.1.3 GFP-LC3和mRFP-GFP-LC3质粒转染HBE细胞观察PM诱导细胞自噬的发生.36-38
• 3.2 细胞自噬在PM上调人气道上皮细胞IL-8表达中的作用38-43
• 3.2.1 PM干预使人气道上皮细胞IL-8 mRNA水平表达升高38-39
• 3.2.2 细胞自噬在PM上调人气道上皮细胞IL-8中的作用39-43
• 3.3 Beclin1+/-小鼠对PM引起的急性气道炎症具有保护作用43-48
• 3.3.1 Beclin1+/_小鼠PM引起的气道炎症中中性粒细胞浸润减少43-44
• 3.3.2 Beclin1+/-小鼠抑制PM上调的中性粒细胞趋化因子的表达44-45
• 3.3.3 Beclin1+/-小鼠对PM引起的急性气道炎症肺组织病理学检查的影响45-48
• 第四章 讨论48-52
• 第五章 结论52-54
• 参考文献54-58
• 综述58-68
• 参考文献63-68
• 作者筒历及在读期间所取得的科研成果68-69

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本文编号：383614