dsODNs靶向封闭肺泡巨噬细胞NF-κB信号通路的抗炎作用机制研究

发布时间：2017-05-22 13:19

  本文关键词：dsODNs靶向封闭肺泡巨噬细胞NF-κB信号通路的抗炎作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:评估脂质体转染的双链寡聚脱氧核苷酸(ds ODNs)竞争性抑制对肺泡巨噬细胞(AMs)中核因子-κB(NF-κB)与DNA结合活性的影响效能,确定脂质体转染dsODNs的最适浓度及最佳转染时间,验证dsODNs-decoy策略靶向封闭肺泡巨噬细胞中NF-κB信号通路的可行性,并探讨其抗炎作用机制。方法:在动物实验中取出家兔的支气管肺组织,用温生理盐水灌洗提取肺泡巨噬细胞,经提纯鉴定后,分对照组、LPS刺激组、Lipofectamine2000组和不同比例dsODNs-Lipofectamine2000组,分别给予不同处理后培养。各组在培养4 h、6 h、8 h三个时间点,用LDH试剂盒检测各组细胞培养上清液中LDH含量,了解不同处理对AMs的毒性损害;用共聚焦激光显微镜观察不同时间点及不同比例dsODNs-Lipofectamine2000组AMs中荧光分布情况;用流式细胞仪检测不同比例dsODNs-Lipofectamine2000组中AMs的荧光强度及细胞摄取率确定最佳转染条件;RT-PCR检测dsODNs转染后AMs中IL-1β、IL-6、TNF-α因子的mRNA表达;Western-blot检测ds ODNs-Lipofectamine2000转染后AMs内NF-κB p65亚基在细胞质及细胞核中的分布情况。结果:转染AMs的dsODNs-Lipofectamine2000浓度比为1:5时,LDH检测细胞毒性适中,转染效率最佳;从荧光强度、细胞状态及转染效率等方面综合分析,转染6 h为最佳时间;与LPS组比较,dsODNs-Lipofectamine2000组中IL-1β、IL-6、TNF-α炎症介质的mRNA表达均明显被抑制,差异具有统计学意义(P0.05);Western-blot结果显示,经ds ODNs-Lipofectamine2000处理后,AMs细胞质中NF-κB p65亚基的表达明显多于细胞核中。结论:dsODNs-Lipofecetamine2000能在体外有效转染AMs,并成功抑制AMs中NF-κB相关炎性基因的转录表达;结果显示dsODNs-decoy策略可以抑制炎症效应细胞中NF-κB信号通路,用于临床治疗SIRS/ALI具有可行性。其作用机制除dsODNs可干扰NF-κB/DNA结合活性外,还可能通过抑制细胞质中的NF-κB与I-κB解离,从而抑制NF-κB活化,减少活化的NF-κB p65的入核,阻断NF-κB介导的炎症信号通路。
【关键词】：核因子-κB 双链寡聚脱氧核苷酸 肺泡巨噬细胞
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R56
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-14
• 文献回顾14-25
• 1 实验材料25-29
• 1.1 实验动物25
• 1.2 实验主要仪器25-26
• 1.3 实验主要试剂及配制26-29
• 2 实验方法29-38
• 2.1 支气管肺泡灌洗法分离提取AMs29-30
• 2.2 AMs的鉴定与培养30-32
• 2.3 实验分组32
• 2.4 LDH试剂盒检测各组细胞毒性32-33
• 2.5 共聚焦激光显微镜观察AMs摄取经FITC标记dsODNs后的荧光分布33
• 2.6 流式细胞仪检测细胞内相对荧光强度和细胞摄取率33
• 2.7 RT-PCR检测炎性介质基因mRNA的表达33-35
• 2.8 Western-blot检测AMs内NF-κB p65蛋白在细胞质和细胞核的表达35-38
• 2.9 统计分析38
• 3 实验结果38-43
• 3.1 不同转染时间AMs培养液中LDH含量比较38-39
• 3.2 不同dsODNs-Lipofectamine2000比例AMs培养液中LDH含量比较39
• 3.3 AMs摄取经FITC标记dsODNs后的荧光分布比较39-41
• 3.4 不同比例dsODNs-Lipofectamine2000时转染效率比较41-42
• 3.5 AMs中炎性介质基因mRNA的表达比较42
• 3.6 AMs细胞质和细胞核中NF-κB p65的表达比较42-43
• 4 讨论43-48
• 小结48-50
• 参考文献50-56
• 个人简历和研究成果56-57
• 致谢57

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本文编号：385839