miRNA-186-5p在慢性阻塞性肺疾病支气管上皮细胞中的作用及其调控机制探究

发布时间：2024-07-05 22:06

　　目的:本课题组前期通过慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的miRNA转录组分析发现,miRNA-186-5p在COPD中表达存在差异,可能在COPD的发生发展中起重要作用,但其具体作用机制不明。进一步的生物信息学分析发现,miR-186-5p可与lncRNA RP11-20G6.3及HIF-1α靶向结合。因此,本研究拟从细胞水平探究miRNA-186-5p在COPD中的生物学功能,并揭示miRNA-186-5p与lncRNA RP11-20G6.3及HIF-1α的靶向调控作用,初步在细胞水平探究lncRNA RP11-20G6.3对COPD发生的影响,同时在COPD患者血清中验证lncRNA RP11-20G6.3表达水平,为揭示其分子机制提供理论依据。方法:(1)采用脂多糖(LPS)诱导炎症构建人支气管上皮(BEAS-2B)细胞模型。(2)分别合成miR-186-5p、lncRNA RP11-20G6.3低表达序列并转染细胞,用CCK-8法检测细胞增殖活性、流式检测细胞凋亡及细胞周期;RT-qPCR检测TNF-α、...

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略对照表
第1章 绪论
    1.1 慢性阻塞性肺疾病简介
    1.2 miRNA在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展
    1.3 ceRNA调控网络在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展
第2章 实验方法
    2.1 实验主要仪器与试剂
        2.1.1 主要实验仪器
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 引物与转染序列
    2.2 实验方法
        2.2.1 实验对象与标本收集
        2.2.2 血液样本采集
        2.2.3 RNA的提取
        2.2.4 RNA浓度测定
        2.2.5 RNA反转录
        2.2.6 荧光定量PCR
        2.2.7 细胞总蛋白提取及浓度测定
        2.2.8 Western Blot
        2.2.9 ELISA
        2.2.10 细胞培养及LPS诱导炎症模型建立
            2.2.10.1 细胞培养
            2.2.10.2 脂多糖LPS诱导炎症细胞模型构建
        2.2.11 细胞转染
        2.2.12 细胞增殖检测(CCK-8法)
        2.2.13 细胞凋亡检测(AnnexinV-FITC/PI法)
        2.2.14 细胞周期分析(PI染色法)
        2.2.15 lncRNA-miRNA靶基因预测与双荧光素酶实验验证
        2.2.16 统计学方法
第3章 实验结果
    3.1 miR-186-5p在 COPD中的功能研究
        3.1.1 miR-186-5p低表达/过表达BEAS-2B细胞系的建立
        3.1.2 LPS诱导的细胞COPD炎症模型构建
        3.1.3 构建COPD炎症模型中IL-6、TNF-ɑ的表达检测
        3.1.4 低表达miR-186-5p检测其表达改变对细胞行为的影响
            3.1.4.1 低表达miR-186-5p抑制BEAS-2B细胞增殖活性
            3.1.4.2 低表达miR-186-5p促进BEAS-2B细胞凋亡
            3.1.4.3 miR-186-5p对 BEAS-2B细胞周期的影响
        3.1.5 miR-186-5p对 BEAS-2B细胞NF-κB炎症相关信号通路的影响
            3.1.5.1 qRT-PCR检测miR-186-5p对BEAS-2B细胞对NF-κB炎症通路基因表达水平的影响
            3.1.5.2 Western Blot检测miR-186-5p对BEAS-2B细胞对NF-κB炎症通路蛋白表达水平的影响
    3.2 LncRNA RP11-20G6.3在COPD中的功能研究
    3.3 miR-186-5p对 HIF-1ɑ和 LncRNA RP11-20G6.3 的调控作用探究
        3.3.1 miR-186-5p对 HIF-1ɑ的调控关系探究
            3.3.1.1 生物信息数据库预测miR-186-5p与 HIF-1ɑ的靶向结合
            3.3.1.2 miR-186-5p低表达/高表达对HIF-1ɑ基因的影响
            3.3.1.3 miR-186-5p低表达/高表达对HIF-1ɑ蛋白的影响
            3.3.1.4 双荧光素酶报告实验验证miR-186-5p与 HIF-1ɑ的直接靶向关系
        3.3.2 LncRNA RP11-20G6.3对miR-186-5p的调控关系探究
            3.3.2.1 生物信息数据库预测LncRNA RP11-20G6.3对miR-186-5p的靶向结合
            3.3.2.2 双荧光素酶报告实验验证miR-186-5p与 LncRNA RP11-20G6.3的直接靶向关系
    3.4 LncRNA RP11-20G6.3在COPD患者中的表达检测
        3.4.1 样本的一般特征
        3.4.2 qRT-PCR检测外周血LncRNA RP1120G6.3 基因表达
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间的科研成果
致谢



本文编号：4001610