bFGF基因转染BMSCs对肺微血管内皮细胞的作用研究

发布时间：2017-06-09 17:16

  本文关键词：bFGF基因转染BMSCs对肺微血管内皮细胞的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:COPD是一种常见的慢性呼吸道疾病,当前治疗主要以控制症状为主,本研究采用基因转染技术,将碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞后,与肺微血管内皮细胞共培养,观察转染后的干细胞对肺微血管细胞的作用,以探索治疗COPD的新思路及新方法。方法:选取4周龄的SD大鼠(雄雌不限),采用骨髓贴壁细胞培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。外购b FGF-pc DNA3.1重组质粒,采用脂质体转染法将含有b FGF基因的质粒转染入BMSCs,荧光显微镜观察转染效率,Western-blot法观察重组质粒b FGF-pc DNA3.1转染及其目的蛋白的表达。转染后的b FGF-pc DNA3.1-BMSCs通过与肺微血管内皮细胞在transwell体系下共培养。本课题分为6个实验组,一个空白对照组,6个实验组分别为重组质粒组(A组)、空白质粒组(B组)、重组质粒转染组(C组)、空白质粒转染组(D组)、BMSCs组(E组)、PBS组(F组),空白对照组:单纯的肺微血管内皮细胞培养组,A组:重组质粒b FGF-pc DNA3.1与肺血管内皮细胞共培养,B组:空白质粒pc DNA3.1与肺血管内皮细胞共培养,C组:b FGF-pc DNA3.1-BMSCs与肺血管内皮细胞共培养,D组:pc DNA3.1-BMSCs与肺血管内皮细胞共培养,E组:BMSCs与肺血管内皮细胞共培养,F组:PBS液与血管内皮细胞共培养,以上各组细胞共培养后24h,48h,72h后观察肺微血管内皮细胞的增殖率情况。结果:1、成功提取并培养BMSCs,流式细胞仪表型检测CD29、CD90阳性,CD34及CD11B阴性,所鉴定的即为所需BMSCs;2、质粒转染BMSCs后,荧光显微镜可见绿色荧光蛋白,初步表转染成功;3、重组质粒携带的b FGF基因成功转染入BMSCs中并通过Western-blot法检测其大量表达b FGF蛋白;4、重组质粒转染组为肺血管内皮细胞增值率最高的组别,其与PBS组、重组质粒及空白质粒组的细胞增值率对比,其均P0.05;与空白质粒转染组及BMSCs组相比,统计后均P0.05,但其较空白质粒转染组及BMSCs组肺微血管内皮细胞的增殖率有增高趋势,且增高趋势随共培养时间延长,增高趋势越明显。空白质粒转染组与PBS组、重组质粒及空白质粒组的细胞增值率对比,均P0.05,与BMSCs组相比,P0.05。BMSCs组与PBS组、重组质粒及空白质粒组的细胞增值率对比,均P0.05。结论:1.采用脂质体转染法成功将b FGF基因导入BMSCs并能大量表达b FGF蛋白;2.BMSCs具有刺激肺血管内皮细胞增殖作用;3.转染b FGF基因的BMSCs具有刺激肺微血管内皮细胞增殖作用且具有时间依赖性,较未转染b FGF基因的BMSCs作用更强,但统计后两组增值率差异无统计学差异。
【关键词】：碱性成纤维细胞生长因子 骨髓间充质干细胞 共培养 慢性阻塞性肺病
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.9
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 实验材料13-15
• 2.1 实验动物13
• 2.2 实验仪器13
• 2.3 实验试剂13-14
• 2.4 其他14-15
• 第3章 实验方法与步骤15-25
• 3.1 大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养15
• 3.2 大鼠骨髓间充质干细胞的传代15-16
• 3.3 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定16
• 3.4 重组质粒bFGF-pc DNA3.1 及质粒pcDNA3.1 的获取16
• 3.5 重组质粒bFGF-pc DNA3.1 及质粒pcDNA3.1 的扩增16-18
• 3.6 重组质粒bFGF-pc DNA3.1 及质粒pcDNA3.1 的提取18-19
• 3.7 检测提取质粒的浓度19
• 3.8 测试G418 最低筛选浓度19
• 3.9 重组质粒及空白质粒的转染19-20
• 3.10 G418 筛选稳定转染细胞20-21
• 3.11 验证转染细胞bFGF的表达21-23
• 3.12 大鼠肺微血管内皮细胞的获取及传代及冻存23
• 3.13 大鼠肺微血管内皮细胞及大鼠间充质干细胞的共培养23-24
• 3.14 肺微血管内皮细胞的CCK-8 检测24
• 3.15 统计学方法24-25
• 第4章 实验结果25-29
• 4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养25
• 4.2 第3代BMSCs的培鉴定25
• 4.3 大鼠肺微血管内皮细胞的培养25
• 4.4 提取的重组质粒及空白质粒的浓度测定25-26
• 4.5 测试G418 最低筛选浓度26
• 4.6 重组质粒以及空白pcDNA3.1 质粒转染BMSCs后荧光蛋白表达26
• 4.7 Western-blot方法检测bFGF基因的表达26-27
• 4.8 细胞共培养后肺血管内皮细胞的增殖结果27-29
• 第5章 实验讨论29-33
• 第6章 结论与展望33-34
• 6.1 结论33
• 6.2 展望33-34
• 致谢34-35
• 参考文献35-37
• 附图37-41
• 综述41-46
• 参考文献44-46

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 柳涛;蔡柏蔷;;慢性阻塞性肺疾病诊断、处理和预防全球策略(2011年修订版)介绍[J];中国呼吸与危重监护杂志;2012年01期

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本文编号：436155