Caspase-1在不可分型流感嗜血杆菌致呼吸道感染中的作用研究

发布时间：2017-08-07 11:16

  本文关键词：Caspase-1在不可分型流感嗜血杆菌致呼吸道感染中的作用研究

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【摘要】：不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)是流感嗜血杆菌中的无荚膜型,为机会致病菌,是小儿中耳炎和成人下呼吸道感染最重要的病原体。NTHi引起的下呼吸道感染与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的急性发作密切相关,主要与NTHi感染导致的机体固有免疫功能缺失、气道屏障系统破坏和肺组织损伤有关。研究表明,NTHi感染引起的气道炎症反应主要是通过激活促炎症因子IL-1β、CXCL-2和TNF-α的释放,而这些前炎症因子的高表达是通过Toll样受体(TLRs)激活MAPK和NF-κB这两条细胞信号传导通路来完成的。近期研究表明NOD样受体(NLRs)信号通路是固有免疫应答的重要组成部分,其在抵御病原体感染的过程中发挥了重要作用。NLRs蛋白3,NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrin domain3)炎性小体能够活化Caspase-1进而产生并释放成熟的促炎因子白细胞介素1β和白细胞介素18,参与体内炎症反应。Caspase-1是NLRP3炎症复合体中的一种重要蛋白,NLRP3炎症复合体诱导组装后会激活Caspase-1,剪切pro-IL-1β和pro-IL-18转化成有成熟的IL-1β和IL-18,从而引发前炎性反应和抗菌反应。有研究发现NLRP3炎性小体和Caspase-1的激活与李斯特菌和金黄色葡萄球菌感染引起的先天性免疫应答密切相关,而其与NTHi在呼吸道感染中的关系却鲜见报道。为完成此研究,本实验首先选用不同浓度的NTHi感染人肺泡上皮细胞株(A549)建立呼吸道感染体外模型,进而研究NTHi对A549的存活及凋亡的影响并以分子生物学手段分析NLRP3炎性小体、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达情况,以及检测A549中的炎症因子IL-6和TNF-α在中的含量。我们又以NTHi感染小鼠,建立呼吸道感染体内模型,并应用HE染色和免疫组化等方法检测气道组织损伤和Caspase-1表达情况,同时RT-PCR检测肺组织中Caspase-1、NF-κB和IL-1β的m RNA水平。体外实验结果表明,1、NTHi在培养9~13h后进入对数生长期,得出细菌对数生长期方程为:Y=0.586x+8.015(R=0.985);2、不同浓度的NTHi感染降低细胞存活率,并增加凋亡和坏死的细胞数量,同时上调炎症细胞因子IL-6和TNF-α的表达;3、不同浓度的NTHi感染A549导致IL-1β和IL-18的表达水平随着细菌浓度的增高而增高,而当NTHi浓度达到1×108 CFU/m L时,Caspase-1的表达开始出现减少,同时IL-1β和IL-18的表达继续增加。体内实验结果表明:1、NTHi感染能导致小鼠肺泡间隔断裂,炎症细胞浸润,组织损伤程度与细菌浓度相关;2、NTHi感染上调小鼠气道组织中Caspase-1的表达,同时上调NF-κB和IL-1βm RNA。结论:1、NTHi感染可能会通过上调固有免疫中炎性小体的重要组分——Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达,促进细胞炎症的产生,降低A549细胞存活率并诱导细胞凋亡和死亡。2、NTHi可能通过NF-κB途径上调固有免疫分子Caspase-1的表达致BALB/c小鼠出现呼吸道黏膜损伤,引发下呼吸道感染。
【关键词】：不可分型流感嗜血杆菌 A549 炎症反应 固有免疫 Caspase-1
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R56
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 中英文对照表12-14
• 第一章 绪论14-19
• 1.1 不可分型流感嗜血杆菌与呼吸道疾病的关系14-15
• 1.2 固有免疫15-17
• 1.3 不可分型流感嗜血杆菌与固有免疫的研究现况17-19
• 第二章 体外实验研究19-38
• 2.1 实验材料19
• 2.1.1 实验用细胞株19
• 2.1.2 实验用细菌菌株19
• 2.2 实验试剂与仪器19-21
• 2.2.1 主要试剂19-21
• 2.2.2 主要仪器与设备21
• 2.3 主要试剂配制21-23
• 2.3.1 巧克力琼脂培养基的配制21-22
• 2.3.2 细菌冻存液22
• 2.3.3 NTHi增菌液22
• 2.3.4 细胞冻存液22
• 2.3.5 0.4%台盼蓝染液22
• 2.3.6 Western Blot实验材料22-23
• 2.3.7 ELISA实验材料23
• 2.4 实验方法23-28
• 2.4.1 NTHi的分离培养及其生长曲线的绘制23-24
• 2.4.2 A549细胞的培养24
• 2.4.3 NTHi感染A549细胞模型的建立24
• 2.4.4 不同浓度NTHi对细胞活力和凋亡的影响24-25
• 2.4.5 WB检测NTHi标准株和临床株感染的A549细胞产生的Caspase-1，IL-1β 和IL-18蛋白表达水平25-27
• 2.4.6 ELISA法检测NTHi标准株和临床株作用后细胞因子TNF-α 和IL-6 的蛋白表达水平27
• 2.4.7 数据处理和统计学分析27-28
• 2.5 实验结果28-36
• 2.5.1 NTHi分离培养及细菌生化反应和革兰染色形态鉴定28-29
• 2.5.2 NTHi生长曲线的绘制29
• 2.5.3 NTHi在对数生长期活菌数与OD600值的函数关系29-30
• 2.5.4 NTHi抑制A549细胞存活率30-31
• 2.5.5 NTHi诱导A549细胞凋亡31-32
• 2.5.6 NTHi感染促进A549细胞表达炎症蛋白Caspase-1，IL1β和IL-1832-34
• 2.5.7 NTHi感染促进A549细胞分泌炎性细胞因子TNF-α 和IL-634-36
• 2.6 讨论36-38
• 第三章 体内研究38-51
• 3.1 实验材料38-39
• 3.1.1 实验动物38
• 3.1.2 实验试剂38-39
• 3.1.3 实验仪器39
• 3.2 实验方法39-43
• 3.2.1 NTHi引起的呼吸道感染动物模型的建立39-40
• 3.2.2 小鼠肺组织和气管HE染色40
• 3.2.3 小鼠的气管和肺组织免疫组织化学染色40-41
• 3.2.4 RT-PCR检测小鼠肺组织Caspase-1、NF- κB和IL-1βm RNA表达41-43
• 3.2.5 统计学分析43
• 3.3 实验结果43-49
• 3.3.1 小鼠呼吸道感染NTHi43-44
• 3.3.2 NTHi感染损伤小鼠气管和肺组织44-46
• 3.3.3 NTHi感染上调小鼠气管和肺组织中Caspase-1 的表达46-48
• 3.3.4 NTHi上调小鼠肺组织中Caspase-1，NF-κB和IL-1βm RNA水平48-49
• 3.4 讨论49-51
• 第四章 结论51-52
• 参考文献52-59
• 攻读硕士期间所取得的科研成果59-60
• 致谢60

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