缺第4和5外显子的IL-7剪接变异体蛋白表达及活性研究

发布时间：2017-08-13 10:31

  本文关键词：缺第4和5外显子的IL-7剪接变异体蛋白表达及活性研究

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【摘要】：研究背景:机体多种细胞都能产生IL-7,其主要生物作用是参与机体的免疫调节;IL-7有多个剪接变异体,其生物活性的研究才刚刚开始。研究报道IL-7具有强大的抗纤维化作用,其作用机制主要为通过激活JAK1/STAT1信号通路上调Smad7表达及下调TGF-β1的表达以阻断TGF-β诱导胶原合成。IL-7δ4/5是IL-7缺第4和第5外显子的剪接变异体,其生物学作用的研究才刚展开,其是否也影响肺纤维化的发生发展亦有待研究。研究目的:本课题利用原核表达载体pET-21b表达IL-7δ4/5蛋白,包涵体经溶解、复性、纯化后,获得复性的高纯度的蛋白质,经Western-blot鉴定后,采用TGF-β1和IL-7作为对照分析其对肺成纤维细胞MRC-5的影响,并初步探讨其作用机制。研究方法:1.IL-7δ4/5蛋白的制备:以18-T-IL-7δ4/5(实验室保存)作为模板进行亚克隆,在成功构建IL-7δ4/5原核表达质粒pET-21b-IL-7δ4/5后,进行诱导剂诱导表达和蛋白质可溶性分析,进一步优化其诱导浓度和诱导时间,以确定最佳参数。IL-7δ4/5蛋白包涵体经溶解后,蛋白的复性用梯度透析法,纯化用亲和层析色谱法。纯化后,以鼠抗人IL-7抗体和6×His单克隆抗体为一抗,分别对IL-7δ4/5蛋白进行Western Blot鉴定。2.IL-7δ4/5蛋白对人胚肺成纤维细胞MRC-5的影响:分别用IL-7、IL-7δ4/5和TGF-β1作用于MRC-5细胞,细胞增殖用MTT法检测,collagenI、α-SMA蛋白表达用Western-blot法检测。结果:1.IL-7δ4/5蛋白的诱导表达、复性及纯化:重组表达质粒p ET-21b-IL-7δ4/5构建成功。进行PCR检测,扩增的目的片段约为345bp,和预期结果相符;测序分析发现:结果与GenBank中IL-7δ4/5基因序列完全一致。质粒转染成功的阳性克隆进行培养和IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳证实其诱导表达成功。分离纯化的包涵体进行溶解、稀释与梯度透析后,IL-7δ4/5蛋白的复性效率达到45%,利用亲合层析色谱法纯化后,蛋白质的纯度达到了95%以上,最后用Western Blot法进行证实。2.IL-7δ4/5蛋白对MRC-5细胞的作用:TGF-β1、IL-7、IL-7δ4/5分别作用于体外培养的MRC-5细胞,结果TGF-β1能明显促进细胞的增殖(P0.01),明显诱导细胞collagen I、α-SMA蛋白表达的增加(P0.01)。IL-7表现出明显抑制细胞增殖(P0.01),降低细胞collagen I、α-SMA蛋白表达的作用(P0.01),而IL-7δ4/5对MRC-5细胞的增殖以及collagenI、α-SMA蛋白的表达都没有影响。这表明IL-7δ4/5对于肺纤维化没有作用。
【关键词】：缺乏第4和第5外显子的IL-7剪接变异体 蛋白表达 活性研究 肺纤维化
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 第一章 序言9-14
• 1.1 研究背景9-12
• 1.1.1 剪接变异体的成因9-10
• 1.1.2 选择性剪接与疾病10
• 1.1.3 白细胞介素 7（IL-7）10-11
• 1.1.4 白细胞介素7剪接变异体11-12
• 1.2 研究思路12-14
• 第二章 剪接变异体蛋白rhIL-7δ4/5 的原核表达、纯化以及鉴定14-40
• 2.1 前言14
• 2.2 主要试剂材料14-23
• 2.2.1 细菌菌种14
• 2.2.2 质粒载体14
• 2.2.3 分子生物学试剂14-15
• 2.2.4 引物设计与合成15
• 2.2.5 相关仪器15-16
• 2.2.6 主要溶液配制16-23
• 2.3 实验方法23-33
• 2.3.1 感受态DH5α 及BL21的制备23-24
• 2.3.2 重组表达质粒的构建24-26
• 2.3.3 rhIL-7δ4/5 蛋白诱导表达条件的优化、可溶性鉴定26-27
• 2.3.4 rhIL-7δ4/5 蛋白变性与复性27-29
• 2.3.5 rhIL-7δ4/5 蛋白的纯化29-30
• 2.3.6 rhIL-7δ4/5 蛋白Western-blot鉴定30-33
• 2.4 实验结果33-37
• 2.4.1 成功构建重组表达质粒33-34
• 2.4.2 rhIL-7δ4/5 蛋白诱导表达条件优化、可溶性分析34-36
• 2.4.3 rhIL-7δ4/5 蛋白的复性及纯化36-37
• 2.4.4 Western-blot鉴定rhIL-7δ4/5 蛋白37
• 2.5 讨论37-40
• 第三章 rhIL-7δ4/5 蛋白对肺成纤维细胞株MRC-5 的影响40-55
• 3.1 前言40-41
• 3.2 实验材料41-44
• 3.2.1 细胞株41
• 3.2.2 主要试剂41
• 3.2.3 主要仪器设备41
• 3.2.4 主要溶液配制41-44
• 3.3 实验方法44-49
• 3.3.1 MRC-5 细胞培养方法44-45
• 3.3.2 TGF-β1 对MRC-5 增殖及collagenI蛋白、α-SMA蛋白表达的影响45-48
• 3.3.3 rhIL-7δ4/5 蛋白对MRC-5 增殖及collagenI蛋白、α-SMA蛋白的影响48-49
• 3.4 实验结果49-53
• 3.4.1 MTT法检测细胞增殖率49-50
• 3.4.2 Western Blot检测collagenI蛋白、α-SMA蛋白的表达50-53
• 3.5 讨论53-55
• 全文总结55-56
• 研究展望56-57
• 参考文献57-64
• 攻读学位期间发表的论文64-65
• 附录1 英文缩写语中文对照65-67
• 致谢67-68

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本文编号：666842