Rab5介导的β-AR囊泡运输调控肺微血管内皮细胞损伤的机制

发布时间：2017-08-19 14:39

  本文关键词：Rab5介导的β-AR囊泡运输调控肺微血管内皮细胞损伤的机制

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【摘要】：急性呼吸窘迫综合症早期特征是肺微血管内皮细胞(PMECs)损伤后通透性增高，肺泡与肺间质内积聚大量的水肿液，肺微血管内皮完整性是治疗和预防发生ARDS的重要环节。Beta-肾上腺素受体(Beta-adrenergic receptorβ-AR)在调控内皮细胞过程中发挥重要作用。β-ARs具有三种亚型，β1-AR和β2-AR主要在心脏、肺脏等重要脏器血管系统发挥一定的作用，而β3-AR主要与脂肪组织相关。受体信号通路的激活与受体的内吞、脱敏、循环和降解等密切相关，任何影响这些过程的因子都可能对内皮细胞的功能发挥调节作用。我们既往研究表明Rab1可调节β-AR在细胞膜上的表达，从而调控LPS损伤肺微血管内皮细胞过程的机制，为临床药物干预提供了新的靶点和策略。 Rab5作为Ras超家族的一个成员，主要有Rab5a、Rab5b和Rab5c三种亚型，研究最多的是Rab5a。在HEK293、cos-1等细胞，，Rab5主要调控细胞囊泡从细胞膜向早期内涵体的锚定和融合，同时其介导的内吞过程可能参与激动剂诱导的受体下调。但是，在肺微血管内皮细胞，Rab5介导β-ARs的内吞和下调的机制以及对屏障功能和通透性的调控作用尚未研究。 本实验利用LPS处理大鼠肺微血管内皮细胞，模拟急性呼吸窘迫综合症的细胞病理，转染野生型和负性突变体的Rab5a以及小干扰RNA，研究了Rab5a调控肺微血管内皮细胞β-AR胞内运输、膜上的表达、内吞和下调等过程的机制，同时，研究了β-AR信号通路的激活与内皮细胞紧密连接和粘附连接的调控关系，以及Rab5a如何参与调控β-AR信号通路调节肺微血管内皮细胞屏障功能及渗透性。 研究方法： 1.采用原代培养技术培养大鼠PMECs，并对其进行综合鉴定：CD34、BSI、Ⅷ因子，同时观察各代细胞的结构和亚结构。 2.实时细胞监测仪iCELLigence系统对细胞屏障功能进行实时监测。 3.运用WesternBlot检测LPS处理RPMECs后occludin蛋白和VE-cadherin蛋白在膜和浆内表达情况。 4.应用荧光显微镜观测转染Rab5a WT、Rab5a S34N、Rab5a siRNA后β2肾上腺素受体在细胞内的亚定位。 5.应用内吞实验和下调实验检测转染Rab5aWT、Rab5asiRNA后β2肾上腺素受体的内吞和下调变化。 6.运用ELISA法检测RPMECs经LPS处理以及转染Rab5asiRNA后监测细胞指数改变。 研究结果： 1.综合鉴定结果显示：CD34，Ⅷ因子和BSI结合试验阳性，电镜下可见细胞膜，细胞核，内质网，线粒体及溶酶体等亚结构。 2.LPS处理RPMECs后细胞指数呈时间和浓度依赖形式降低，屏障功能在6-8h之间破坏最明显。同时，occludin蛋白和VE-cadherin蛋白在膜上的表达显著降低。β2肾上腺素受体激活能减弱细胞指数的降低程度，同时也能抑制两种连接蛋白的减低。 3.正常情况下，β2-AR主要聚集在胞膜，加入激动剂ISO后，主要聚集在胞浆；转染Rab5aWT后，β2-AR主要聚集在胞膜，加入激动剂ISO后，主要聚集在胞浆；转染Rab5asiRNA后，β2-AR主要聚集在胞膜，加入激动剂ISO后，仍然聚集在胞膜。 4.转染Rab5aS34N和Rab5asiRNA后，膜表面β-AR分别增加23.9%和28.3%，β2-AR分别增加32.1%和35.6%，转染Rab5aWT无明显改变。LPS处理RPMECs后β2-AR降低42%，可被Rab5aS34N和Rab5asiRNA分别提高39%和37%。 5.[3H]-CGP12177诱导的受体内吞在30min时达到最高，Rab5asiRNA显著抑制内吞速率；Rab5aWT无明显作用。ISO诱导的受体下调在16h达到最低，Rab5asiRNA显著抑制受体下调；Rab5a无明显作用。 6.Rab5a基因下调后对内皮屏障功能无明显改变，但转染后加入激动剂ISO或ISO/Atenolol后，LPS对内皮屏障功能的破坏作用较正常组明显减弱。同时，内皮细胞对BSA的通透性也有相似的改变。 结论： 1.β2-AR信号通路对LPS导致的RPMECs屏障功能的破坏有一定的保护作用。 2.Rab5a可调节β2-AR的胞内转运和膜上的表达。 3.Rab5a通过调节β2-AR调控RPMECs的屏障功能和对大分子的渗透性。
【关键词】：肺微血管内皮细胞 脂多糖 急性呼吸窘迫综合征 屏障功能 渗透性 β肾上腺素受体 Rab5a蛋白 Rab5aWT Rab5aS34N siRNA
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 缩略语表5-6
• Abstract6-10
• 摘要10-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 β2-AR信号通路参与调节大鼠肺微血管内皮细胞 (PMECs) 的屏障功能14-31
• 2.1 大鼠肺微血管内皮细胞的培养和鉴定14-20
• 2.1.1 材料与方法14-17
• 2.1.2 结果17-20
• 2.1.3 讨论20
• 2.1.4 小结20
• 2.2 β2-A R 信号通路调控大鼠肺微血管内皮细胞( PMEC s)的屏障功能20-31
• 2.2.1 材料与方法20-25
• 2.2.2 结果25-27
• 2.2.3 讨论27-29
• 2.2.4 小结29-31
• 第三章 Rab5a对β-AR在大鼠肺微血管内皮细胞膜表达及胞内运输的影响31-45
• 3.1 Rab5a对β-AR在大鼠肺微血管内皮细胞胞内转运及膜表达的影响31-40
• 3.1.1 材料和方法31-35
• 3.1.2 结果35-39
• 3.1.3 讨论39-40
• 3.1.4 小结40
• 3.2 Rab5a对β-AR在大鼠肺微血管内皮细胞内吞和下调的影响40-45
• 3.2.1 材料和方法40-42
• 3.2.2 结果42-43
• 3.2.3 讨论43-44
• 3.2.4 小结44-45
• 第四章 Rab5a对大鼠肺微血管内皮细胞屏障功能及渗透性的影响45-51
• 4.1 材料和方法45-46
• 4.2 结果46-49
• 4.3 讨论49-50
• 4.4 小结50-51
• 全文结论51-52
• 参考文献52-56
• 文献综述 Rab5蛋白的研究进展56-67
• 参考文献62-67
• 在读期间发表论文67-68
• 致谢68

本文编号：701298