二氧化氮诱导大鼠哮喘易感性变化的分子机制研究

发布时间：2017-08-22 03:00

  本文关键词：二氧化氮诱导大鼠哮喘易感性变化的分子机制研究

  更多相关文章： 二氧化氮(NO_2) 哮喘 Th1/Th2失衡 Th2优势应答 易感性 JAK/STAT6信号通路 卵蛋白(OVA)

【摘要】：近年来,随着工业化持续快速推进、城市机动车数量迅猛增加,城市化进程不断加快,以及煤炭、石油等能源利用迅猛增长,我国大气污染日益严重,给居民健康造成了严重的威胁。目前我国大气污染呈现出煤烟型与机动车污染共存的新型复合污染,霾和光化学烟雾频繁及NO2浓度居高不下的状况。NO2作为大气污染物主要成分之一,逐渐引起了世界各国的普遍关注。监测数据显示,城市室外NO2浓度一般不超过0.5 ppm,在交通拥堵的高峰期,可高达到4 ppm。室内NO2污染也不容忽视,其浓度也可高达2 ppm。文献提示,呼吸系统是NO2的主要毒性作用靶器官,NO2吸入后可进入下呼吸道直至肺的深部,主要引起深部呼吸道、细支气管及肺泡损伤。因此,NO2污染与呼吸系统损伤和疾病的相关性引起了人们的重视。支气管哮喘(简称哮喘),是由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子共同参与的一种慢性气道炎症,表现为Th1和Th2细胞失衡及Th2细胞优势应答。目前全世界支气管哮喘患者约3亿人,我国的哮喘发病率为1%,儿童高达3%。近年来,越来越多的流行病学研究表明,NO2污染与居民哮喘发病率和死亡率的增高相关,特别是会使儿童哮喘发病率增加。到目前为止,NO2与哮喘的相关性研究主要集中在流行病学领域,且研究结果不一致,尚缺乏直接的实验证据。此外,关于NO2诱导哮喘易感性变化的分子机理的实验研究还鲜见报道。由此提出本课题,研究NO2暴露对肺的炎症损伤效应及其与哮喘的相关性,在此基础上探讨NO2诱导哮喘易感性增加的免疫调节机制及其可能的分子信号通路。1.本课题通过对成年正常大鼠进行动式NO2急性熏气染毒,每天5h,连续7 d,染毒剂量为5 mg/m3,研究急性NO2吸入暴露诱导成年大鼠肺炎症损伤效应及哮喘相关基因的变化。采用酶联免疫技术测定肺组织Th2细胞因子IL-4含量,采用实时定量RT-PCR技术测定肺组织IFN-γ、Muc5ac、T-bet和GATA3 mRNA的表达。结果显示,急性NO2吸入暴露即可诱导大鼠肺组织IL-4含量增加,引起肺组织Muc5ac和GATA3mRNA的表达升高及T-bet和IFN-y mRNA的表达降低。这一结果表明急性NO2吸入暴露造成T-bet/GATA3表达失衡,进而引起Thl/Th2失衡,这可能是NO2暴露引起大鼠气道炎症及气道黏液高分泌的重要机制之一,同时也可能是NO2污染地区哮喘发病率逐年上升的一个重要原因。2.在日常生活中,人们对NO2的接触往往是慢性的、低剂量的。而且哮喘本身也是一种慢性气道炎症反应。然而,在慢性的、低剂量的接触情况下NO2是否通过调控T-bet/GATA3的表达进而调控哮喘Th1/Th2失衡,最终导致气道炎症及气道黏液高分泌等哮喘样症状尚不清楚,其发生的分子机制更是鲜见报道。因此,在上一部分研究的基础上,采用不同浓度NO2(2和5 mg/m3)对成年正常大鼠进行慢性吸入染毒,每天5 h,连续28 d,考察大鼠肺组织病理特征、超微结构、细胞因子、转录因子及JAK/STAT6信号通路上关键因子的变化,深入探讨NO2对大鼠肺慢性炎症损伤和Th1/Th2细胞失衡及其可能的信号转导途径。组织病理损伤采用常规HE染色技术,超微结构改变采用电镜技术,肺组织Th2细胞因子IL-4含量测定采用酶联免疫技术测定,肺组织IL-1β、ICAM-1、Muc5ac、GATA3、T-bet、IFN-γ、IL-4α、JAKs、STAT6 mRNA表达采用实时定量RT-PCR技术测定,p-ERK1/2、p-Lck、p-NF-κB、p-STAT6蛋白表达采用Western blot技术测定。结果显示,慢性吸入NO2可引起肺组织病理学损伤和超微结构改变,表现为气道上皮细胞破坏,支气管壁增厚,管壁周围可见少量炎症细胞浸润,气管褶皱变厚,气道内可见黏液分泌；电镜结果显示NO2暴露组大鼠肺泡Ⅱ型细胞结构呈现出一定程度的变性,纤毛有所脱落,胶原纤维沉积现象严重。此外,与第二章急性暴露结果相一致,慢性吸入NO2同样可以引起大鼠肺组织转录因子GATA3表达上调,T-bet表达下调,Th2细胞因子IL-4的分泌增加,Thl细胞因子IFN-y表达减少,同时炎性因子IL-1β、黏附分子ICAM-1和黏蛋白基因Muc5ac mRNA表达量也增加,并呈现明显的剂量-效应关系,即使在低浓度暴露组(2mg/m3)也表现出损伤效应；此外,JAK/STAT6信号传导通路中IL-4Rα、JAK1和STAT6表达增加,STAT6、NF-κB、ERK1/2和Lck蛋白的磷酸化水平显著上升,且呈现明显的剂量-效应关系。以上结果表明,慢性NO2吸入暴露可引起正常大鼠肺组织相关基因出现与哮喘患者类似的改变,如Th2细胞因子、黏蛋白基因、粘附因子发生浓度依赖性上调,Th1胞因子下调,在此过程中激活了大鼠肺组织JAK/STAT6信号转导通路及调控因子NF-κB、ERK1/2和Lck蛋白,进而调控Th1/Th2细胞因子的分泌,导致机体Th1/Th2失衡及呈现Th2优势应答。本实验通过N02慢性吸入暴露模型进一步证明N02暴露可以引起机体Th1/Th2失衡及Th2优势应答,并且JAK/STAT6信号转导通路及调控因子NF-κB、ERK1/2和Lck参与了调控。由此提示NO2暴露人群可能较正常人更易患哮喘,以上途径可能是NO2暴露引起气道炎症反应的重要机制之一。3.为了进一步探讨NO2诱导哮喘易感性增加的可能分子机制,本实验通过建立成年大鼠哮喘模型,观察NO2对哮喘大鼠肺组织病理特征、超微结构、细胞因子、转录因子及JAK/STAT6信号通路上关键因子的影响。动物染毒处理：实验用Wistar雄性大鼠(鼠龄为42 d)随机分为3组,分别为对照组、OVA组和NO2+OVA组。首先,NO2+OVA组大鼠暴露于浓度为5mg/m3的NO2,每天5 h,对照组和OVA组暴露于过滤的新鲜空气中5 h,连续42 d；其次,OVA组和N02+OVA组在熏气第22 d、29 d分别腹腔注射10%OVA和10%氢氧化铝混合液1mL致敏,第36 d开始连续7 d 1%OVA超声波雾化激发(20 mind)。采用常规HE染色和电镜技术分别考察肺组织病理学和超微结构改变,采用酶联免疫技术测定肺组织IL-4和血清OVA特异性IgE含量,采用实时定量RT-PCR技术测定IL-1β、ICAM-1、Muc5ac、GATA3、T-bet、WN-γ、IL-4α、 JAKs、STAT6 mRNA表达,采用Western blot技术测定p-ERK1/2、p-Lck、p-NF-icB、 P-STAT6蛋白表达。结果显示,NO2吸入暴露加重哮喘大鼠肺组织炎性细胞浸润、气道黏液分泌等病理学改变及胶原纤维增生、纤毛脱落等超微结构改变；N02吸入暴露促进哮喘大鼠IL-4、IL-1β、ICAM-1、Muc5ac、GATA3表达及血清OVA特异性IgE含量持续增加,而IFN-γ、T-bet表达进一步减少；NO2暴露促进哮喘大鼠肺组织JAK/STAT6信号转导通路及调控因子NF-κB、ERK1/2和Lck蛋白的激活水平。以上结果表明,NO2暴露增加成年大鼠哮喘易感性,其可能通过促进T-bet/GATA3比例失调,加重Th1/Th2偏移,进而调控Th1/Th2细胞因子的分泌,同时诱导JAK/STAT6信号转导通路及调控因子NF-κB、ERκ1/2和Lck激活水平上升,从而加重哮喘的炎症反应和过敏性反应,这可能是暴露于NO2的人群更敏感、更易患哮喘,其发生哮喘时的反应更严重的重要机制之一,同时也证实NO2污染是哮喘发病率增加的一个重要诱因。4.流行病学研究显示,NO2暴露对不同年龄的人群所诱导的哮喘症状不同,其哮喘发作程度也不同。儿童发病率较成年人更高,作者推测儿童可能较成年人更敏感,更易发生哮喘或哮喘发作程度更严重。因此,本实验通过建立幼年大鼠哮喘模型,验证NO2暴露是否通过与成年人相同的机制诱导儿童哮喘易感性增加。实验用Wistar雄性大鼠(鼠龄为21 d)随机分为3组,分别为对照组、OVA组和NO2+OVA组。动物染毒处理和实验方法同第三部分。结果显示,通过比较NO2暴露下幼年和成年哮喘大鼠的上述指标后发现,幼年大鼠上述指标的变化较成年大鼠更明显,提示幼年大鼠对NO2更敏感,损伤效应更严重,这一结果解释了作者之前的推测,这可能是NO2污染地区儿童比成年人哮喘发病率高的一个重要原因。5.研究发现,哮喘儿童外周血淋巴细胞DNA断裂程度增加,可能与哮喘患者机体ROS过量积累所导致的氧化损伤有关。而N02本身能否引起哺乳动物DNA损伤,进而影响哮喘疾病的发生发展,尚未见文献报道。为此,本研究通过建立整体动物染毒模型,研究了NO2吸入诱导大鼠DNA损伤效应,旨在探讨其诱导哮喘易感性变化的可能原因。结果显示,NO2急性和慢性吸入暴露均可导致大鼠肺细胞DNA断裂程度增加、DPC系数上升及骨髓微核发生率升高,且存在明显的剂量-效应关系。说明NO2吸入暴露可诱导机体遗传物质受损,其可能与自由基氧化损伤有关,这可能是NO2暴露诱导哮喘易感性增加的一个重要原因。本研究阐明了NO2对肺的炎症损伤效应,确立了NO2暴露与哮喘发生的相关性及其分子机制,并建立了NO2暴露风险评价的效应标记；在此基础上进一步明确了NO2诱导哮喘(尤其是儿童哮喘)易感性增加的分子机制及其可能信号转导通路,为污染地区患者寻找新的治疗靶点提供理论依据。
【关键词】：二氧化氮(NO_2) 哮喘 Th1/Th2失衡 Th2优势应答 易感性 JAK/STAT6信号通路 卵蛋白(OVA)
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R562.25;X51
【目录】：

• 中文摘要15-19
• ABSTRACT19-26
• 第一章 文献综述26-48
• 1.1 二氧化氮的健康效应研究进展26-35
• 1.1.1 NO_2污染现状26-29
• 1.1.2 NO_2的流行病学和毒理学研究进展29-35
• 1.2 哮喘发病机理研究进展35-45
• 1.2.1 概述35-39
• 1.2.2 哮喘发病机理39-43
• 1.2.3 JAK/STAT6信号转导通路与哮喘研究进展43-45
• 1.3 本课题的立题依据及研究内容45-48
• 1.3.1 本课题的目的和意义45-47
• 1.3.2 课题的研究内容47-48
• 第二章 急性吸入NO_2诱导成年大鼠肺炎症损伤效应48-56
• 2.1 前言48
• 2.2 材料与方法48-51
• 2.2.1 主要试剂与仪器48-49
• 2.2.2 NO_2动态吸入染毒处理49
• 2.2.3 IL-4的ELISA检测49
• 2.2.4 实时定量RT-PCR测定mRNA表达水平49-51
• 2.2.5 统计学数据处理51
• 2.3 结果51-53
• 2.3.1 急性吸入NO_2对大鼠肺组织Muc5ac mRNA表达的影响51-52
• 2.3.2 急性吸入NO_2对大鼠肺组织炎症因子IL-4和IFN-γ的影响52
• 2.3.3 急性吸入NO_2对大鼠肺组织T-bet/GATA3 mRNA表达的影响52-53
• 2.4 讨论与结论53-56
• 第三章 慢性吸入NO_2诱导成年大鼠肺炎症反应及其与Th1/Th2失衡的关系56-73
• 3.1 前言56-57
• 3.2 材料与方法57-61
• 3.2.1 主要试剂与仪器57-58
• 3.2.2 NO_2动态吸入染毒处理58
• 3.2.3 组织病理学HE检测58-59
• 3.2.4 肺组织超微结构观察59
• 3.2.5 IL-4的ELISA检测59
• 3.2.6 实时定量RT-PCR测定mRNA表达水平59-60
• 3.2.7 Western blot方法测定目的蛋白的表达60-61
• 3.2.8 统计学数据处理61
• 3.3 结果61-69
• 3.3.1 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织病理学的影响61-62
• 3.3.2 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织超微结构的影响62
• 3.3.3 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织Muc5ac mRNA表达的影响62-63
• 3.3.4 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织IL-1β和ICAM-1 mRNA表达的影响63-64
• 3.3.5 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织IL-4和IFN-γ表达的影响64-65
• 3.3.6 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织T-bet/GATA3 mRNA表达的影响65-66
• 3.3.7 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织IL-4Rα和JAK1 mRNA表达的影响66
• 3.3.8 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织STAT6表达的影响66-68
• 3.3.9 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织NF-κB蛋白激活的影响68
• 3.3.10 慢性吸入NO_2对大鼠肺组织ERK1/2和Lck蛋白激活的影响68-69
• 3.4 讨论与结论69-73
• 第四章 NO_2诱导成年大鼠哮喘易感性增加的分子机制研究73-89
• 4.1 前言73
• 4.2 材料与方法73-75
• 4.2.1 主要试剂与仪器73
• 4.2.2 动物染毒处理73-74
• 4.2.3 支气管肺泡灌洗及细胞分类计数74
• 4.2.4 组织病理学HE检测74
• 4.2.5 肺组织超微结构观察74
• 4.2.6 IL-4和OVA特异性IgE的ELISA检测74
• 4.2.7 实时定量RT-PCR测定mRNA表达水平74
• 4.2.8 Western blot方法测定目的蛋白的表达74
• 4.2.9 统计学数据处理74-75
• 4.3 结果75-85
• 4.3.1 各组成年大鼠临床表现75
• 4.3.2 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织病理学的影响75
• 4.3.3 NO_2对成年哮喘大鼠BALF中白细胞百分比的影响75-76
• 4.3.4 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织超微结构的影响76-77
• 4.3.5 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织Muc5ac mRNA表达的影响77-78
• 4.3.6 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织IL-1β和ICAM-1 mRNA表达的影响78-79
• 4.3.7 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织IL-4和IFN-γ表达的影响79
• 4.3.8 NO_2对成年哮喘大鼠血清OVA特异性IgE含量的影响79-80
• 4.3.9 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织T-bet/GATA3 mRNA表达的影响80-81
• 4.3.10 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织IL-4Rα和JAKs mRNA表达的影响81-82
• 4.3.11 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织STAT6表达的影响82-84
• 4.3.12 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织NF-κB蛋白激活的影响84
• 4.3.13 NO_2对成年哮喘大鼠肺组织ERK1/2和Lck蛋白激活的影响84-85
• 4.4 讨论与结论85-89
• 第五章 NO_2诱导幼年大鼠哮喘易感性增加的分子机制研究89-104
• 5.1 前言89
• 5.2 材料与方法89-90
• 5.2.1 主要试剂与仪器89
• 5.2.2 动物染毒处理89-90
• 5.2.3 支气管肺泡灌洗及细胞分类计数90
• 5.2.4 组织病理学HE检测90
• 5.2.5 肺组织超微结构观察90
• 5.2.6 IL-4和OVA特异性IgE的ELISA检测90
• 5.2.7 实时定量RT-PCR测定mRNA表达水平90
• 5.2.8 Western blot方法测定目的蛋白的表达90
• 5.2.9 统计学数据处理90
• 5.3 结果90-102
• 5.3.1 各组幼年大鼠临床表现90
• 5.3.2 NO_2对幼年哮喘大鼠肺组织病理学的影响90-91
• 5.3.3 NO_2对幼年哮喘大鼠BALF中白细胞百分比的影响91-92
• 5.3.4 NO_2对幼年哮喘大鼠肺组织超微结构的影响92-93
• 5.3.5 NO_2对幼年哮喘大鼠肺组织Muc5ac mRNA表达的影响93-94
• 5.3.6 NO_2对幼年哮喘大鼠肺组织IL-1β和ICAM-1 mRNA表达的影响94-95
• 5.3.7 NO_2对幼年哮喘大鼠肺组织IL-4和IFN-γ表达的影响95
• 5.3.8 NO_2对幼年哮喘大鼠血清OVA特异性IgE含量的影响95-96
• 5.3.9 NO_2对幼年哮喘大鼠肺组织T-bet/GATA3 mRNA表达的影响96-97
• 5.3.10 NO_2对幼年哮喘大鼠肺组织IL-4Rα和JAKs mRNA表达的影响97-98
• 5.3.11 NO_2对幼年哮喘大鼠肺组织STAT6表达的影响98-100
• 5.3.12 NO_2对幼年哮喘大鼠肺组织NF-κB蛋白激活的影响100-101
• 5.3.13 NO_2对幼年大鼠肺组织ERK1/2和Lck蛋白激活的影响101
• 5.3.14 NO_2暴露下成年大鼠与幼年大鼠哮喘特征性指标的比较101-102
• 5.4 讨论与结论102-104
• 第六章 NO_2暴露对大鼠的遗传毒性研究104-111
• 6.1 前言104
• 6.2 材料与方法104-106
• 6.2.1 主要试剂与仪器104-105
• 6.2.2 实验大鼠NO_2动态吸入染毒处理105
• 6.2.3 DNA断裂程度检测105-106
• 6.2.4 DNA-蛋白质交联(DPC)系数的测定106
• 6.2.5 微核测定106
• 6.2.6 统计学数据处理106
• 6.3 结果106-109
• 6.3.1 急性NO_2暴露对大鼠的遗传毒性106-108
• 6.3.2 慢性NO_2暴露对大鼠的遗传毒性108-109
• 6.4 讨论与结论109-111
• 第七章 结论111-113
• 7.1 急性NO_2吸入暴露诱导成年大鼠肺组织气道炎症反应,引起Th1/Th2失衡111
• 7.2 慢性NO_2吸入暴露诱导Th1/Th2失衡及Th2优势应答,并且JAK/STAT6信号转导通路参与了调控111
• 7.3 NO_2吸入诱导哮喘大鼠易感性增加,且幼年期更敏感,其机制涉及促进Th1/Th2失衡及JAK/STAT6信号转导通路过度活化111-112
• 7.4 NO_2吸入对大鼠DNA造成损伤112-113
• 参考文献113-128
• 致谢128-129
• 附录129-132
• 博士研究生期间发表的论文129-130
• 参编著作130-131
• 主持和参与科研项目131-132
• 个人简况132-134

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李敏然,郑劲平;气道高反应性测定的现代临床进展[J];国外医学.呼吸系统分册;1998年01期

2 王少利,郭新彪,张金良;北京市大气污染对学龄儿童呼吸系统疾病和症状的影响[J];环境与健康杂志;2004年01期

3 蔡萌;庞兴龙;;机动车氮氧化物污染现状与减排措施[J];北方环境;2013年06期

4 郝吉明;程真;王书肖;;我国大气环境污染现状及防治措施研究[J];环境保护;2012年09期

5 闫静;王文川;杨g，

本文编号：716649