矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对脂多糖诱导内皮细胞的保护作用及其在急性肺损伤中治疗作用

发布时间：2017-08-22 14:15

  本文关键词：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对脂多糖诱导内皮细胞的保护作用及其在急性肺损伤中治疗作用

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【摘要】：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是急性肺损伤(ALI)的严重的形式。是由除心源性以外的各种肺内外致病因素(严重感染、创伤、有害气体吸入等)造成弥漫性的肺部急性炎症、肺间质和肺泡水肿,临床上常常表现为进行性的呼吸困难和顽固性的低氧血症。其病程凶险,进展迅速,预后差,死亡率高。ARDS/ALI的发病机制可能与炎性介质、氧化应激产物、血管内皮和肺泡上皮损伤等多种因素有关。大量炎性介质和细胞因子导致肺微血管通透性增加,造成肺的顺应性降低及肺表面张力增大,进而肺泡塌陷、肺有效通气面积减少,导致V/Q比例严重失调,从而形成进行性的低氧血症。近期研究发现,及时有效的抗炎、抗氧化等措施可以提高肺组织的氧合能力,对改善肺功能、纠正低氧血症等有重要意义。脂多糖(1 ipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌(gramnegative bacterium, G-)细胞壁的主要致病因素,因此,腹腔内注射LPS可以诱导内毒素相关性ALI/ARDS,并能很好地模拟临床中出现的因严重感染而引发的ARDS/ALI.脂多糖主要通过激活多种炎性或效应细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等),诱发大量细胞因子和炎症介质(如TNF-α、 IL-1β、IL-6等)、氧自由基(ROS)及氧化应激相关因子(MDA、SOD等)的过度失控性释放,从而引起肺泡间微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的损伤,使肺微血管的通透性增高,导致肺间质水肿及肺脏透明膜形成,造成弥漫幽市损伤。这些参与炎症反应的炎性细胞及其释放的细胞因子、活性氧物质、以及相应的信号转导,在ARDS/ALI的发生、发展的中心环节,是形成ARDS/ALI的病理生理学基础。NF-κB和MAPK信号通路的活化在ARDS的疾病发展过程中发挥重要的作用。NF-κB和MAPK信号通路可以通过LPS调节释放的前炎症因子,如TNF-α、IL-6、IL-1β等的刺激而活化。同时,ROS也参与了NF-κB的活化,增强细胞质的信号途径,导致NF-κB向核内转运,氧化-还原反应控制NF-κB形成的几个关键步骤。矢车菊素-3-O-葡糖苷(C3G),是自然界中分布最广的植物色素,是一种属于黄酮类化合物的花色苷,其广泛存在于如杨梅、蓝莓、紫甘薯等人类植物膳食成分中。既往的研究发现,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷能够使细胞膜具抗脂质过氧化和清除氧自由基作用,并能通过作用于炎症和氧化应激相关细胞信号通路而影响内皮细胞,从而防范内皮细胞功能紊乱的进展。本研究将复制脂多糖诱导的小鼠及HUVEC体内/外模型,探讨矢车菊素-3-O-葡糖苷从抗炎、抗氧化等应激反应,细胞信号转导等多角度在ARDS/ALI病理生理过程中的作用,深入探讨C3G对ARDS的保护作用机制,为临床防治急性呼吸窘迫综合症提供一个新的解决思路和研究方法。实验方法：(一)体外试验：体外正常条件下培养HUVEC细胞,所有试验用3-8代细胞。相应实验分组：(1)对照组：细胞培养基中加入平衡PBS溶液,体积与LPS模型组和LPS+C3G组相等；(2)LPS模型组：细胞培养基中加入LPS (1μg/mL); (3)LPS+C3G组：细胞培养基中先加入C3G,一小时后加入LPS(浓度为1 μg/mL)。MTT法测定细胞的活力及C3G的细胞毒性、酶联免疫吸附试验法测定细胞培养液上清中细胞炎性因子(TNF-α, IL-6和IL-1β)水平。(二)体内试验：成年雄性昆明小鼠(8-10周龄,18-20g),随机分为正常对照组、LPS造模组,LPS+C3G预处理组。C3G(12.5 mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)腹膜内注射在LPS (20 mg/kg)刺激前1小时进行预处理,LPS注射后6小时后麻醉处死,测量支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数(总细胞、巨噬细胞数、中性粒细胞数)及酶联免疫吸附试验法测定细胞炎性因子水平(TNF-α, IL-6和IL-1p),以及肺组织匀浆中髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平。测量肺组织湿/干比、肺组织HE染色；运用相关Western blot技术,检测LPS诱导下ARDS相关的重要信号通路NF-κB和MAPK中关键调节蛋白活化状态(p65/p-p65、IκB/p-IκB、 MEK/p-MEK、JNK/p-JNK、P38/p-P38、ERK/p-ERK等)水平。结果：与LPS对照组相比,C3G显著降低脂多糖导致的急性肺损伤小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数、嗜中性粒细胞计数和巨噬细胞计数,明显减低肺组织匀浆中丙二醛含量、髓过氧化物酶活性,显著提高肺组织中的超氧化物歧化酶活性,并能够降低肺湿/干重比、改善肺组织炎症病理变化的严重程度。通过酶联免疫吸附实验测定,C3G湿著抑制了脂多糖诱导的人气静脉内皮细胞北清液和小鼠肺组织支气管肺泡灌洗液(BALF)中促炎细胞因子(TNF-α, IL-6和IL-1p)的产生；在小鼠肺组织Western印迹分析中,矢车菊素-3-O-葡糖苷(50mg/kg)预处理组能通过阻断IκBα, NF-κB/ P65, ERK, p38和JNK的磷酸化,显著抑制LPS诱导核因子-κB通路及丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号传导途径。总之,C3G能够通过抗炎和抗氧化及抑制NF-κB和MAPK通路的活化,而在改善肺损伤的严重程度中发挥重要作用。
【关键词】：矢车菊素-3-O-葡糖苷(C3G) 脂多糖(LPS) 急性呼吸窘迫综合症/急性肺损伤(ARDS/ALI) 核因子-κB(NF-κB) 丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)
【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-8
• 英文缩略语一览表8-10
• 前言10-14
• 材料与方法14-30
• 结果30-32
• 讨论32-34
• 参考文献34-39
• 综述 杨梅提取物生物活性39-45
• 参考文献42-45
• 致谢45-46
• 学位论文目录46-47
• 附录1 附图47-51

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本文编号：719594