骨髓间充质干细胞（BMSC）旁分泌角化细胞生长因子（KGF）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠肺泡上皮细胞（MLE12）损伤的

发布时间：2017-08-23 13:37

  本文关键词：骨髓间充质干细胞（BMSC）旁分泌角化细胞生长因子（KGF）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠肺泡上皮细胞（MLE12）损伤的修复作用及机制

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【摘要】：研究课题:骨髓间充质干细胞(BMSC)旁分泌角化细胞生长因子(KGF)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠肺泡上皮细胞(MLE12)损伤的修复作用及机制研究背景:急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指是由感染、机械刺激、休克、输血等病因导致的肺毛细血管内皮和肺泡上皮弥漫性损害,以急性顽固性低氧血症为临床表现的急性呼吸衰竭,目前尚无有效治疗手段改善ARDS的病死率。动物及细胞研究显示,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstem cells,BMSCs)通过归巢、移植再生作用、免疫调节、调节肺泡液清除率、改变肺血管内皮通透性及其他机制促进肺损伤修复,为ARDS早期治疗提供新思路。前期研究发现,MSC能明显修复LPS诱导的ARDS小鼠肺上皮损伤,同时伴有肺泡灌洗液中KGF水平明显增加,而KGF能影响肺上皮细胞的生长、分化和成型,因此可以推断MSC可能通过旁分泌KGF修复ARDS肺上皮损伤,近年来许多研究发现了RAGE对于肺上皮的重要修复作用,因此上皮细胞的RAGE可能是KGF发挥作用的关键分子。研究目的:本研究拟在体外BMSC与肺泡上皮细胞间接共培养模型的基础上,通过干预MSC的RAGE表达,探讨ARDS时BMSC旁分泌KGF对肺泡上皮修复作用,以及上皮细胞的RAGE在BMSC旁分泌KGF对LPS诱导的肺泡上皮损伤修复中起到的作用,从而更好的理解MSC治疗ARDS的机制,为今后改善MSC对ARDS的治疗效果提供新的研究基础。研究方法:1.建立LPS诱导的MLE12细胞损伤模型、体外间接共培养实验模型及细胞处理细胞分组如下:空白组:MLE12单独培养;损伤肺泡上皮细胞组:MLE12加入LPS孵育;间接共培养对照组:MLE12与MSC间接共培养;间接共培养损伤组:MLE12与MSC间接共培养加入LPS孵育;KGF组:MLE12加入LPS孵育,加入KGF;RAGE抗体组:MLE12与MSC共培养加入LPS加RAGE抗体。2.标本的采集和检测:间接共培养1d,3d或7d后,收集MLE12细胞,应用western blot方法测定细胞中RAGE,ZO-1的含量;收集三个时间点的培养基,应用ELISA方法测定培养基上清液中KGF,RAGE的含量。3.统计学方法:用SPSS统计学软件进行统计分析,变量以均数+标准差(mean+SD)表示,多组计量资料间比较采用Bonferroni校正检验分析,以P0.05提示差异有统计学意义。结果:1.MSC对肺上皮损伤有修复作用。在1d、3d、7d的3个时间点,各组MLE12表面的ZO-1表达,WB结果显示损伤组较空白对照组相比ZO-1蛋白表达量下降(P0.05);间接共培养损伤组较间接损伤组相比ZO-1蛋白表达量增加(P0.05),KGF组较损伤组相比ZO-1蛋白表达量明显增加(P0.05);2.MSC修复上皮损伤,可能通过旁分泌KGF。在1d、3d、7d的3个时间点,各组条件培养基KGF表达,ELISA结果显示损伤组较空白对照组相比,培养基上清液中KGF因子表达量下降(P0.05);间接共培养损伤组较损伤组相比,培养基上清液中KGF因子表达量增加(P0.05)。3.MSC旁分泌KGF修复上皮损伤可能与调节上皮细胞的RAGE表达有关。在1d,3d的时间点各组上皮细胞RAGE表达,WB结果显示间接共培养损伤组较损伤组相比,RAGE蛋白表达量有所上升(P0.05);损伤组基础上加入KGF的KGF组较损伤组相比,RAGE蛋白表达量明显增加(P0.05)。在1d、3d、7d的3个时间点,各组条件培养基中RAGE的表达,ELISA结果显示损伤组较空白组相比,培养基上清液中RAGE因子表达量下降(P0.05);间接共培养损伤组较间损伤组相比,培养基上清液中RAGE因子表达量上升(P0.05);损伤组基础上加入KGF的KGF组较损伤组相比,培养基上清液中RAGE因子表达量明显上调。结论:1.BMSC对LPS诱导MLE12细胞损伤有修复作用。2.BMSC旁分泌产生KGF因子在修复LPS诱导的MLE-12细胞损伤有重要作用,是肺泡上皮损伤修复的主要决定因素。3.BMSC旁分泌KGF修复LPS诱导MLE-12细胞损伤可能通过调节肺泡上皮细胞的RAGE表达实现,因此RAGE可能是MSC旁分泌KGF修复ARDS时肺泡上皮损伤的关键分子。
【关键词】：间充质干细胞 急性呼吸窘迫综合征 角质细胞生长因子 晚期糖基化终末产物受体 脂多糖
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-11
• 第一章、主要实验材料、仪器与试剂11-14
• 1.1、实验细胞11
• 1.2、主要器材11
• 1.3、主要试剂11-12
• 1.4、主要试剂配制12-14
• 第二章、实验方法14-21
• 2.1 建立脂多糖（LPS）诱导小鼠肺泡上皮细胞（MLE-12）损伤模型14-15
• 2.2 建立体外间接共培养实验模型15-16
• 2.3 体外培养模型的分组与处理16-17
• 2.4 WB检测各组MLE12细胞中RAGE和ZO-1 的蛋白表达水平17-21
• 第三章、结果21-36
• 3.1 实验各组细胞培养状态一般概述21-24
• 3.2 WB检测各组MLE12细胞中RAGE和ZO-1 的蛋白表达水平24-29
• 3.3 ELISA法检测各组培养基上清液中KGF，RAGE的含量29-36
• 第四章、讨论36-48
• 第五章、结论48-49
• 参考文献49-55
• 缩略词表55-57
• 文献综述57-65
• 参考文献63-65
• 攻读学位期间的研究成果65-66
• 致谢66-67

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