重组大鼠CC16蛋白质对LPS诱导的气道上皮细胞炎症因子表达的抑制作用及机制研究

发布时间：2017-09-15 04:19

  本文关键词：重组大鼠CC16蛋白质对LPS诱导的气道上皮细胞炎症因子表达的抑制作用及机制研究

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【摘要】：CC16蛋白质主要由位于终末细支气管的无纤毛柱状上皮细胞(Clara cell)分泌产生,其分子量接近16k D,所以称之为CC16。目前认为CC16是肺的内源性抗炎因子,具有重要的免疫炎症调节作用。慢性炎症性肺部疾病例如COPD,患者肺内Clara细胞及CC16明显降低,促进了疾病的发生发展。参与COPD发病的重要炎症介质包括MMP-9,IL-6,IL-8,TNF-α,而NF-κB信号通路在炎症反应中具有重要地位。外源性给予抗炎因子CC16,有可能抑制炎症介质的产生,从而对炎症性肺部疾病产生治疗干预作用。本研究首先利用基因工程技术,诱导表达重组的CC16蛋白质,纯化并鉴定具有生物学活性后,用于炎症干预研究。通过LPS刺激诱导体外培养的大鼠气道上皮细胞,产生一系列炎症介质,给予重组的CC16蛋白质进行干预后,观察各炎症因子的变化。进一步应用分子生物学技术,探讨重组CC16抑制炎症因子产生的分子机制。为重组CC16作为抗炎剂用于炎症性肺疾病,如COPD等疾病的治疗提供理论依据。第一部分大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表达及纯化目的:克隆大鼠Clara细胞分泌蛋白(CC16)基因,原核表达并纯化重组的CC16蛋白,为进一步研究CC16蛋白的功能及对炎症性肺部疾病的治疗作用奠定基础。方法:制备大鼠肺组织总RNA,根据大鼠CC16基因全长编码序列(Gen Bank登录号:NM_013051)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入p ET30a(+)原核表达载体,重组质粒转化感受态细胞(E.coli DH5α),阳性克隆经菌液PCR、双酶切及测序进行鉴定。将重组质粒p ET30a(+)-r CC16转化至E.coli Rosetta(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,重组融合蛋白经Ni2+琼脂糖凝胶亲和纯化。分别以抗His标签抗体和山羊抗CC16抗体进行免疫印迹(Western blotting)分析并鉴定重组蛋白。采用高效液相色谱法测定重组蛋白的纯度。结果:RT-PCR扩增产物约为290 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒p ET30a(+)-r CC16构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约16 k D的可溶性重组蛋白。免疫印迹(Western blotting)结果表明,诱导表达的蛋白质为带His标签的重组融合蛋白,而且能被山羊抗CC16抗体识别。经测定重组CC16蛋白质纯度为96.03%结论:成功构建基因重组体p ET30a(+)-r CC16,并制备出可溶性大鼠重组CC16蛋白质。第二部分重组CC16蛋白质通过NF-κB信号通路抑制脂多糖(LPS)诱导的气道上皮炎症介质的表达第一节重组CC16蛋白质对LPS诱导的IL-8、IL-6、TNF-:和MMP-9表达的影响目的:明确重组大鼠CC16(r CC16)对LPS诱导的炎症介质的干预作用。方法:(1)采用酸碱滴定法,通过测定磷脂酶A2(PLA2)的活性,验证重组的CC16蛋白质是否具有生物学活性。(2)体外培养大鼠气道上皮(RTE)细胞,以不同剂量r CC16(5、10和20μg/ml)与RTE共孵育1、3、5、7天,采用CCK-8试剂盒和台盼蓝染色法测定r CC16对RTE细胞增殖及活力的影响。(3)体外培养RTE细胞,加入LPS(0.1μg/ml)刺激细胞,并以不同剂量r CC16(0.5、1.0和2.0μg/ml)进行干预24h。采用ELISA法测定细胞上清中MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-α的含量;采用反转录q PCR法测定各组细胞MMP-9、IL-6和TNF-αm RNA水平;采用明胶酶谱法测定MMP-9的活性。结果:(1)体外实验显示r CC16可抑制PLA2的活性,并呈剂量依赖性,在剂量为0.5μg/ml时即有抑制作用,随着剂量的增大(1.0和2.0μg/ml),r CC16对PLA2的抑制作用更加明显。(2)r CC16在较大剂量时(10μg/ml和20μg/ml)对RTE细胞的增殖有抑制作用,但对RTE的细胞活性无影响。根据以上两部分实验结果,我们选择低剂量r CC16(小于5μg/ml)作为干预研究的剂量,该剂量下r CC16对细胞增殖及活性无影响,同时又具备了生物活性。(3)LPS刺激RTE细胞24h后,MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-αm RNA及蛋白含量较对照组明显升高,MMP-9活性亦增高。给予不同剂量r CC16干预后,LPS诱导的上述炎症介质的表达被抑制。r CC16对MMP-9、IL-6和IL-8的抑制作用呈剂量依赖性,随着r CC16剂量增加抑制作用增强,而对TNF-α的抑制则表现为低剂量r CC16(0.5μg/ml)强于较高剂量组。结论:r CC16蛋白质具有抗炎活性,在不影响RTE细胞增殖及活性的剂量下,可抑制LPS诱导的MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-αm RNA及蛋白的表达。第二节重组CC16蛋白质抑制LPS诱导的NF-κB的活化及其机制研究目的:探讨r CC16抑制LPS诱导的炎症因子表达的分子机制。方法:体外培养RTE细胞,加入LPS刺激细胞,并以不同剂量r CC16进行干预1h。以双荧光素酶报告基因系统检测各组NF-κB的转录活性。提取胞核蛋白,采用电泳迁移率(EMSA)实验检测NF-κB与靶基因的结合能力。分别提取胞浆、胞核蛋白,采用Western blotting法检测NF-κBp65的核浆含量,同时用免疫荧光染色显示NF--κBp65的胞内分布。应用Western blotting检测LPS刺激及r CC16干预后RTE细胞I-κBα、p-I-κBα、p-NF-κB、total NF-κB、p38和p-p38的变化。结果:(1)LPS刺激后NF-κB转录活性明显增高,较空白对照组高出约9倍。1μg/ml和2μg/ml的r CC16均可明显抑制LPS诱导的NF-κB的转录活性,并呈剂量依赖性,抑制率分别为38.8%和62.6%。(2)LPS可促进RTE细胞NF-κB与DNA的结合,而1μg/ml和2μg/ml的r CC16可明显抑制LPS诱导的NF-κB与DNA的结合。(3)LPS刺激RTE细胞后,细胞核内NF-κB含量明显增多,给予不同剂量r CC16干预后,细胞核内NF-κB含量较单纯LPS组明显降低,并具有剂量依赖性,随着r CC16剂量增加,细胞核内NF-κB含量更少。(4)LPS刺激RTE细胞后磷酸化的IκBα、NF-κBp65和p38明显增多。不同剂量r CC16干预后,它们的磷酸化水平较单纯LPS刺激组下降,并呈剂量依赖性,随r CC16剂量增加对IκBα、NF-κBp65和p38磷酸化的抑制作用增加。结论:r CC16可通过两条途径抑制LPS诱导的RTE细胞抑制NF-κB的活化:①抑制I-κB的磷酸化,从而抑制NF-κB的核定位;②抑制p38的磷酸化,进而抑制NF-κBp65的磷酸化。第三部分重组CC16蛋白质通过网格蛋白介导内吞入胞机制的初步探讨目的:初步探讨网格蛋白介导的内吞(CME)在r CC16进入RTE细胞及其发挥抗炎效应中的作用。方法:(1)体外培养RTE细胞,分为空白对照组、r CC16组和Chlorpromazine(CME抑制剂)+r CC16组。Chlorpromazine+r CC16组在加入Chlorpromazine(30μM)30 min后在加入r CC16(2μg/ml),r CC16组直接在培养基中加入r CC16(2μg/ml)。采用免疫荧光染色法,一抗采用抗His标签抗体,观察各组细胞r CC16的分布情况。(2)体外培养RTE细胞,在培养体系中加入Chlorpromazine抑制网格蛋白介导的内吞作用后,以r CC16干预LPS刺激的细胞,采用Western blotting和免疫荧光染色法检测各组RTE细胞NF-κB的核定位情况,采用Elisa法检测细胞上清中MMP-9的含量。结果:(1)r CC16进入RTE细胞,主要分布于胞浆中,若于r CC16加入前,先给予网格蛋白介导内吞的抑制剂Chlorpromazine,则显示RTE细胞中红色荧光分布明显减少,提示进入细胞内的r CC16减少。(2)在加入r CC16前给予Chlropromazine,则r CC16对LPS诱导的NF-κB核定位的抑制作用减弱,即核内NF-κB含量仍较多,相应地,胞浆中NF-κB含量较r CC16干预组减少。(3)如果在加入r CC16前,给予网格蛋白抑制剂Chlropromazine,则发现r CC16对LPS诱导的MMP-9表达的抑制作用减弱,即上清液中MMP-9含量仍较多。结论:抑制网格蛋白介导的内吞后,r CC16对LPS诱导的NF-κB的活化和MMP-9表达的抑制作用明显减弱,初步证明网格蛋白介导的内吞作用参与了r CC16发挥抗炎作用的过程。
【关键词】：重组CC16蛋白质 脂多糖 核因子-κB 炎症因子 网格蛋白
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R56
【目录】：

• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 常用缩写词中英文对照表18-20
• 前言20-23
• 第一部分 大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16 基因的克隆和原核表达及纯化23-44
• 1 材料与方法23-37
• 1.1 材料23-27
• 1.2 方法27-37
• 2 结果37-42
• 2.1 rCC16 基因的扩增37
• 2.2 pET-30a（+）-rCC16 重组载体的构建与鉴定37-38
• 2.3 重组蛋白CC16 的诱导表达38-39
• 2.4 重组蛋白His-rCC16 的Western blotting鉴定39
• 2.5 重组CC16 蛋白质纯化后纯度粗测39-40
• 2.6 重组CC16 蛋白内毒素含量40
• 2.7 重组CC16 蛋白纯度检测40-42
• 3 讨论42-44
• 第二部分 重组CC16 蛋白质通过NF-κB信号通路抑制脂多糖（LPS）诱导的气道上皮炎症介质的表达44-81
• 第一节 重组CC16 蛋白质对LPS诱导的IL-8、IL-6、TNF-α和MMP-9 表达的影响44-61
• 1 材料和方法44-53
• 1.1 材料44-45
• 1.2 方法45-53
• 2 结果53-61
• 2.1 重组大鼠CC16 蛋白质生物活性53
• 2.2 重组大鼠CC16 对RTE细胞的毒性作用研究53-55
• 2.3 不同剂量r CC16 对LPS诱导的RTE细胞MMP-9、IL-6、IL-8 和TNF-α蛋白水平的影响55-57
• 2.4 不同剂量rCC16 对LPS诱导RTE细胞MMP-9、IL-6 和TNF-α mRNA的影响57-59
• 2.5 不同剂量rCC16 对LPS诱导RTE细胞MMP-9 活性的影响59-61
• 第二节 重组CC16 蛋白质抑制LPS诱导的NF-κB的活化及其机制研究61-81
• 1 材料和方法61-72
• 1.1 材料61-62
• 1.2 方法62-72
• 2 结果72-77
• 2.1 rCC16 对LPS诱导的NF-κB转录活性及DNA结合能力的影响72
• 2.2 rCC16 对LPS诱导的NF-κB核定位的影响72-74
• 2.3 rCC16 对LPS诱导的IκBα磷酸化的抑制作用74-75
• 2.4 rCC16 对LPS诱导的NF-κBp65 和p38 磷酸化的抑制作用75-77
• 3 讨论77-81
• 第三部分 重组CC16 蛋白质通过网格蛋白介导内吞入胞机制的初步探讨81-94
• 1 材料和方法81-86
• 1.1 材料81-82
• 1.2 方法82-86
• 2 结果86-91
• 2.1 rCC16 在RTE细胞的分布86-87
• 2.2 Chlropromazine对rCC16 干预LPS诱导的NF-κB核定位的影响87-89
• 2.3 Chlropromazine对rCC16 干预LPS诱导的MMP-9 表达的影响89-91
• 3 讨论91-94
• 全文主要结论94-95
• 参考文献95-102
• 综述102-114
• 参考文献109-114
• 致谢114-115
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果115-116
• 个人简历116

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：854268