常氧及低氧状态下，Survivin调控ROCK-1促进人肺动脉平滑肌细胞增殖的研究

发布时间：2017-09-27 09:31

  本文关键词：常氧及低氧状态下，，Survivin调控ROCK-1促进人肺动脉平滑肌细胞增殖的研究

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【摘要】：目的:1)观察RhoA蛋白1(Rho associated coiled coil forming protein kinase,ROCK-1)在体外培养的人肺动脉平滑肌细胞(Human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)中的表达;2)探讨促进HPASMCs增殖的相关机制中,生存素(Survivin)、ROCK-1二者之间的调控关系。方法:1.取离体人肺周围的正常组织,体外培养至第3-8代。将细胞分组为如下7组:低氧0h(即常氧,37℃,21%O2,5%CO2)组、低氧(37℃、5%CO2、5%O2、90%N2)0.5h组、低氧1h组、低氧2h组、低氧4h组、低氧8h组、低氧12h组,用实时荧光定量PCR(Quantitative realtime-PCR)检测细胞内ROCK-1 mRNA的表达水平,然后用western blotting和免疫荧光检测ROCK-1蛋白质表达的变化,CCK8检测细胞增殖能力。2.原代培养HPASMCs,体外构建合成出3条ROCK-1小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA),并筛选其中1条抑制HPASMCs中ROCK-1信使RNA(Messenger RNA,mRNA)表达效率最高(至少70%)的siRNA靶序列,体外构建合成出1条Survivin siRNA,同理抑制效率至少70%,利用脂质体2000转染细胞,随后将细胞分为6组,即常氧空白对照组、常氧Survivin siRNA组、常氧ROCK-1 siRNA组、低氧空白对照组、低氧Survivin siRNA组、低氧ROCK-1 siRNA组,用realtime-PCR检测细胞内ROCK-1 mRNA及Survivin mRNA的表达水平,然后用western blotting检测ROCK-1及Survivin蛋白质的表达及变化,CCK8和EDU免疫荧光检测细胞增殖能力。结果:1.realtime-PCR方法检测mRNA水平。发现,低氧处理后ROCK-1mRNA表达明显增加(P0.05),且在低氧4h后表达至高峰(P0.05);同时应用western blot和免疫荧光检测蛋白表达水平,发现,低氧处理后ROCK-1蛋白表达明显增加(P0.05),且在低氧4h后达高峰,而CCK8检测在低氧24h、48h、72h后细胞增殖能力均显著增高(P0.05)。2.Survivin siRNA能下调HPASMCs ROCK-1的mRNA及蛋白表达水平,而ROCK-1 si RNA不能下调HPASMCs中Survivin的mRNA及蛋白表达水平。结论:1.低氧促进HPASMCs增殖。2.低氧可导致HPASMCs中ROCK-1表达增加,提示ROCK-1信号可能参与HPASMCs的增殖。3.Survivin siRNA能抑制ROCK-1在HPASMCs中的表达,反之不然,说明Survivin在HPASMCs增殖信号传导的通路中位于ROCK-1的上游,且Survivin、ROCK-1均促进HPASMCs增殖。
【关键词】：低氧 RhoA蛋白1 生存素 人肺动脉平滑肌细胞 增殖
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.9
【目录】：

• 主要英文缩略词索引4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 前言13-15
• 第2章 实验材料15-19
• 2.1 实验标本15
• 2.2 实验试剂15-16
• 2.3 主要实验仪器16-19
• 第3章 实验方法19-29
• 3.1 原代培养HPASMCs19-20
• 3.1.1 组织取材19
• 3.1.2 细胞培养19-20
• 3.2 人肺动脉平滑肌细胞的染色、鉴定20
• 3.3 实验分组20-21
• 3.4 ROCK-1 si RNA及Survivin siRNA的序列设计和细胞转染21
• 3.5 realtime-PCR21-23
• 3.5.1 细胞RNA的提取21-22
• 3.5.2 紫外吸收法测定RNA的浓度及纯度22
• 3.5.3 cDNA合成22
• 3.5.4 realtime-PCR方法检测HPASMCs中ROCK-1、Survivin的mRNA表达水平22-23
• 3.6 用Western-blot方法检测HPASMCs中ROCK-1、Survivin、β-actin蛋白的表达量23-26
• 3.6.1 细胞总蛋白的提取23-24
• 3.6.2 应用BCA法测定蛋白浓度24
• 3.6.3 蛋白电泳24-25
• 3.6.4 转膜25
• 3.6.5 免疫反应25-26
• 3.6.6 化学发光26
• 3.6.7 胶片图像分析26
• 3.7 细胞增殖检测（CCK8检测）26-27
• 3.8 免疫荧光27-29
• 3.8.1 细胞免疫荧光27
• 3.8.2 EDU免疫荧光27-29
• 第4章 统计学分析29-31
• 第5章 实验结果31-45
• 5.1 HPASMCs的鉴定31-32
• 5.2 常氧及低氧状态下，HPASMCs中ROCK-1 表达情况32-37
• 5.2.1 realtime-PCR检测HPASMCs中ROCK-1 mRNA的表达32-33
• 5.2.2 Western blot检测HPASMCs中ROCK-1 蛋白表达33-34
• 5.2.3 CCK8检测细胞增殖能力34-35
• 5.2.4 免疫荧光检测细胞ROCK-1 蛋白的表达35-37
• 5.3 ROCK-1 与Survivin促进HPASMCs增值信号通路中的关系37-45
• 5.3.1 realtime-PCR检测HPASMCs中ROCK-1 与SurvivinmRNA的表达37-38
• 5.3.2 Western blot检测HPASMCs中ROCK-1、Survivin蛋白质表达38-40
• 5.3.3 CCK8检测HPASMCs增殖40-41
• 5.3.4 EDU免疫荧光检测细胞增殖41-45
• 第6章 讨论45-49
• 第7章 结论49-50
• 参考文献50-55
• 文献综述55-63
• 参考文献60-63
• 附录63-64
• 致谢64-65

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2 ;低氧健身好处多[N];中国中医药报;2003年

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