酸性鞘磷脂酶在二氧化硅致肺纤维化体外模型中的作用

发布时间：2017-09-27 10:31

  本文关键词：酸性鞘磷脂酶在二氧化硅致肺纤维化体外模型中的作用

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【摘要】：摘要：目的观察酸性鞘磷脂酶(ASM)在二氧化硅(Si02)致小鼠胚肺成纤维细胞(NIH3T3)纤维化过程中的变化及规律,探讨ASM在Si02致肺纤维化体外模型中的作用。方法ACP染色法检测小鼠原代巨噬细胞(PAM)细胞纯度；鸡红细胞吞噬实验测定PAM和小鼠胚胎巨噬细胞(RAW.264.7)的吞噬功能；收集SiO2刺激RAW.264.7和PAM细胞培养上清,ELISA法测定其IL-8、TNF-α及TGF-β1的分泌情况；SiO2采用三种方式对NIH3T3进行染毒：(1)SiO2直接刺激组,200mg/LSiO2粉尘直接刺激NIH3T3(2) SiO2间接刺激组,收集200mg/LSiO2粉尘刺激PAM12h的培养上清再刺激NIH3T3(3) ASM抑制剂组,在间接刺激组的基础上加入ASM抑制剂。按上述三种刺激方式6,12,18,24,36和48h后收集细胞样品。高效液相色谱法测定NIH3T3细胞内的ASM活性；消化法测定细胞内羟脯氨酸(HYP)含量；Van Gieson胶原纤维染色法对NIH3T3细胞内胶原纤维进行染色；Western印迹法测定细胞内胶原Ⅲ的表达。结果PAM细胞吞噬功能及分泌白细胞介素8(IL-8)及转化生长因子β1(TGF-β1)活性较RAW.264.7高；SiO2刺激PAM12h,培养上清中IL-8. TGF-β1及肿瘤坏死因子.-α (TNF-α)的分泌中明显增加(P0.01)；直接刺激组中,NIH3T3细胞内ASM活性在36h明显增加而其他时间点无变化,HYP含量在48h明显增加而其他时间点无变化,胶原染色在36h及48h可见红染的胶原纤维但其他时间点无变化,胶原Ⅲ表达在各个时间点表达变化均不明显；间接刺激组中,随着PAM上清作用时间延长,NIH3T3细胞内ASM活性、HYP含量、胶原Ⅲ表达均呈升高的趋势,胶原纤维染色随着PAM上清作用时间延长红染的胶原纤维也越多。ASM抑制剂组中,随着PAM上清作用时间延长,NIH3T3细胞内ASM活性、HYP含量、胶原Ⅲ表达均降低,胶原纤维染色无明显变化。结论本实验条件下,ASM在SiO2致肺纤维化的形成中有重要作用,抑制ASM活性可以有效抑制NIH3T3细胞纤维化的形成。图11幅,表6个,参考文献65篇
【关键词】：酸性鞘磷脂酶 二氧化硅 肺纤维化 巨噬细胞
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 英文~.略表9-10
• 第一章 前言10-14
• 第二章 材料与方法14-21
• 2.1 材料14-16
• 2.1.1 受试细胞及动物14
• 2.1.2 受试物14
• 2.1.3 主要试剂14
• 2.1.4 主要试剂溶液的配置14-15
• 2.1.5 主要仪器15-16
• 2.2 方法16-21
• 2.2.1 实验技术路线16
• 2.2.2 小鼠RAW.264.7及NIH3T3细胞培养16
• 2.2.3 小鼠原代肺泡巨噬细胞收集和纯度测定(ACP染色法)16-17
• 2.2.4 两种类型巨噬细胞吞噬率测定(鸡红细胞吞噬率实验)17
• 2.2.5 细胞存活率测定(MTT法)17-18
• 2.2.6 细胞因子IL-8,TNF-α及TGF-β1的测定(ELISA法)18
• 2.2.7 SiO_2刺激PAM上清液的获取18-19
• 2.2.8 NIH3T3细胞的分组处理19
• 2.2.9 NIH3T3细胞内ASM活性检测(高效液相色谱法)19
• 2.2.10 NIH3T3细胞内羟脯氨酸(HYP)含量测定(消化法)19-20
• 2.2.11 NIH3T3细胞胶原纤维染色(Van Gieson染色法)20
• 2.2.12 NIH3T3细胞内胶原Ⅲ表达测定(Western蛋白印迹法)20
• 2.2.13 统计分析20-21
• 第三章 结果21-32
• 3.1 PAM细胞纯度测定21
• 3.2 RAW.264.7和PAM吞噬功能及分泌功能的比较21-23
• 3.2.1 SiO_2对RAW.264.7与PAM存活率的影响21-22
• 3.2.2 SiO_2 R AW.264.7与PAM吞噬功能的比较22
• 3.2.3 SiO_2对RAW.264.7与PAM分泌IL-8及TGF-β1的比较22-23
• 3.3 SiO_2对PAM分泌IL-8,TNF-α及TGF-β1的时间效应23-24
• 3.4 地昔帕明抑制剂浓度的选择24-25
• 3.4.1 不同浓度地昔帕明对NIH3T3细胞毒性测定24-25
• 3.4.2 不同浓度地昔帕明对ASM活性抑制程度测定25
• 3.5 SiO_2对NIH3T3细胞内ASM活性影响及地昔帕明的干预作用25-27
• 3.6 SiO_2对NIH3T3细胞分泌HYP的影响及地昔帕明的干预作用27-28
• 3.7 SiO_2对NIH3T3细胞胶原纤维表达的影响及地昔帕明的干预作用28-30
• 3.8 SiO_2对NIH3T3细胞胶原Ⅲ表达的影响及地昔帕明的干预作用30-31
• 3.9 NIH3T3细胞内ASM与羟脯氨酸及胶原Ⅲ表达相关性分析31-32
• 第四章 讨论32-38
• 4.1 两种类型巨噬细胞吞噬功能和反应活性的比较与选择32-34
• 4.2 SiO_2诱导PAM细胞分泌IL-8,TNF-α及TGF-β1影响34-35
• 4.3 SiO_2对NIH3T3细胞内ASM活性影响35
• 4.4 SiO_2对NIH3T3细胞纤维化的影响35-36
• 4.5 SiO_2致NIH3T3细胞纤维化形成与ASM的关系36-38
• 第五章 结论38-39
• 参考文献39-44
• 综述44-53
• 参考文献48-53
• 致谢53-54
• 研究生期间的成绩54

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 金丰;蒋盛威;曾明;何兴轩;Edward H SCHUCHMAN;王安;罗磊;王傅;肖芳;关岚;刘新民;钟才高;;酸性鞘磷脂酶在二氧化硅致小鼠胚肺成纤维细胞纤维化体外模型中的作用[J];中国药理学与毒理学杂志;2014年02期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 王宝中;IL-17A在放射性肺损伤中的表达及其作用的研究[D];山东大学;2014年

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本文编号：929189