Notch信号通过ERK途径参与CSE诱导的肺微血管内皮细胞凋亡

发布时间：2017-10-01 00:33

  本文关键词：Notch信号通过ERK途径参与CSE诱导的肺微血管内皮细胞凋亡

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【摘要】：第一部CSE对肺微血管内皮细胞凋亡和Notch信号表达的影响目的:研究香烟烟雾提取物(Cigarette smoking extract,CSE)干预对人肺血管内皮细胞(Human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)凋亡的影响以及CSE能否影响HPMEC中Notch信号的表达。方法:体外培养HPMEC,分别使用不同浓度的CSE(0%,0.5%,1%,2.5%,5%)干预12h以及1%CSE干预不同时间(0,3h,6h,12h,24h),采用Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞技术检测细胞凋亡率。将HPMEC分为对照组和CSE组,后者分别使用1%CSE干预6h、12h、24h,采用Real-time PCR检测各组Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及其靶基因Hes1、Hey2的m RNA表达。使用CSE对HPMEC干预24h,采用Western Blot检测CSE干预前后Notch1、Notch2、Notch4及其靶基因Hes1、Hey2蛋白表达。使用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。P0.05为差异有统计学意义。结果:(1)CSE干预12h,与对照组比较,0.5%CSE即引起HPMEC凋亡增加(P0.05),在0.5%~2.5%浓度范围内,随着CSE浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增高,当浓度达到5%时,细胞凋亡率较2.5%组下降(P0.05),但坏死逐渐明显。(2)选择细胞凋亡率增长最快同时坏死率相对较低的1%CSE作为最佳干预浓度,使用1%CSE干预不同时间,与对照组比较,各CSE组细胞凋亡率均较对照组显著升高,且在3h~12h范围内,随着干预时间的延长,细胞凋亡率逐渐增多,当干预时间达到24h时,细胞凋亡率与12h无显著差异(P0.05)。(3)CSE干预6h,Notch1、Notch4 m RNA表达较对照组增加(P0.05);干预12h,Notch1、Notch4 m RNA表达与对照组比较无统计学差异(P0.05);干预24h时Notch1、Notch4 m RNA及蛋白表达均较对照组显著下降(P0.05)。(4)CSE干预6h,Notch2m RNA表达与对照组无统计学差异(P0.05);干预12h,Notch2m RNA表达与对照组比较亦无统计学差异(P0.05);干预24h时Notch2m RNA及蛋白表达均较对照组显著增加(P0.05)。(5)CSE干预6h,Hes1、Hey2 m RNA表达与对照组比较无统计学差异(P0.05);随着干预时间的延长,Hes1、Hey2 m RNA表达逐渐下降,至干预24h时,Hes1、Hey2 m RNA表达较对照组显著下降(P0.05)。结论:(1)CSE可诱导HPMEC的凋亡,并呈浓度依赖性和时间依赖性。(2)CSE可以抑制Notch1、Notch4表达,促进Notch2表达。(3)CSE可能通过影响Notch信号及其靶基因的表达参与HPMEC凋亡。第二部分Notch1在CSE诱导的肺微血管内皮细胞凋亡中的保护作用目的:研究Notch1是否对CSE诱导的HPMEC凋亡起到保护作用。方法:构建Notch1过表达质粒,并使用慢病毒包装。以Notch1过表达慢病毒转染HPMEC,并使用1%CSE干预24h。将HPMEC分为五个处理组:空白对照组,过表达组,阴性病毒组,CSE+过表达组,CSE+阴性病毒组。Real-time PCR和Western Blot检测各组Notch1 m RNA和蛋白的表达。流式细胞技术检测各组细胞凋亡率。使用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。P0.05为差异有统计学意义。结果:(1)过表达组Notch1的表达水平显著高于空白对照组和阴性病毒组(P0.05);阴性病毒组Notch1的表达与空白对照组无统计学差异(P0.05);CSE干预后,过表达组和阴性病毒组Notch1的表达均较干预前下降(P0.05),但CSE+过表达组仍高于CSE+阴性病毒组(P0.05)。(2)过表达组细胞凋亡率与空白对照组无显著差异(P0.05),均显著低于阴性病毒组(P0.05)。CSE干预后,过表达组和阴性病毒组细胞凋亡率均较未干预前明显增高(P0.05),但过表达组细胞凋亡率仍显著低于阴性病毒组(P0.05)。结论:Notch1对CSE诱导的HPMEC凋亡起到保护作用。第三部分Notch1通过ERK途径抑制肺微血管内皮细胞凋亡目的:探讨Notch1是否通过ERK途径参与CSE诱导的HPMEC凋亡。方法:体外培养HPMEC,首先检测CSE干预前后ERK1、ERK2的变化,将HPMEC分为对照组和CSE组;其次检测Notch1过表达对ERK1、ERK2的影响,将HPMEC分为五个处理组:空白对照组,过表达组,阴性病毒组,CSE+过表达组,CSE+阴性病毒组;最后检测抑制ERK对Notch1的影响以及对细胞凋亡的影响,将HPMEC分为四个处理组:空白对照组,CSE组,PD98059组,CSE+PD98059组。采用Real-time PCR和Western Blot分别检测ERK1、ERK2、Notch1 m RNA和蛋白的表达。流式细胞技术检测各组细胞凋亡率。使用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。P0.05为差异有统计学意义。结果:(1)CSE干预6h,ERK1m RNA表达与对照组无统计学差异(P0.05);随着干预时间的延长,ERK1表达水平逐渐升高,至干预24h时,无论ERK1m RNA还是蛋白表达均较对照组显著增加(P0.05)。(2)CSE干预6h,ERK2m RNA表达较对照组增加(P0.05);随着干预时间的延长,ERK2表达水平逐渐升高,至干预24h时,无论ERK2m RNA还是蛋白表达均较对照组显著增加(P0.05)。(3)过表达组ERK1和ERK2的表达水平均显著低于空白对照组和阴性病毒组(P0.05);阴性病毒组ERK1和ERK2的表达与空白对照组无统计学差异(P0.05);CSE干预后,过表达组和阴性病毒组ERK1和ERK2的表达均较干预前升高(P0.05),但CSE+过表达组仍低于CSE+阴性病毒组(P0.05)。(4)与对照组比较,CSE组、PD98059组、CSE+PD98059组Notch1的表达水平均显著下降(P0.05),但该三组之间比较无统计学差异(P0.05)。(5)与对照组比较,CSE组细胞凋亡率明显增加(P0.05),而CSE+PD98059组细胞凋亡率显著低于CSE组。结论:CSE可以通过抑制Notch1的表达,进而激活ERK途径,最终导致HPMEC凋亡。
【关键词】：肺微血管内皮细胞 香烟烟雾提取物 凋亡 Notch信号 ERK途径
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563
【目录】：

• 本课题资助基金5-6
• 中文摘要6-11
• ABSTRACT11-19
• 缩略词表19-21
• 第一部分CSE对肺微血管内皮细胞凋亡和Notch受体21-56
• 第一章 前言21-23
• 第二章 对象、材料和方法23-36
• 2.1 研究对象23
• 2.2 主要设备和试剂23-27
• 2.3 实验方法27-35
• 2.4 统计学分析35-36
• 第三章 结果36-49
• 3.1 CSE干预对HPMEC凋亡的影响36-39
• 3.2 Real-time PCR检测CSE对HPMEC中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hey2m RNA表达的影响39-45
• 3.3 Western Blot检测CSE对HPMEC中Notch1、Notch2、Notch4蛋白表达的影响45-49
• 第四章 讨论49-55
• 4.1 细胞凋亡机制49-50
• 4.2 内皮细胞凋亡与吸烟以及COPD的关系50-51
• 4.3 Notch信号通路与血管内皮细胞51-52
• 4.4 CSE对HPMEC中Notch受体及其靶基因表达的影响52-55
• 第五章 结论55-56
• 第二部分Notch1在CSE诱导的肺微血管内皮细胞凋亡中的保护作用56-86
• 第一章 前言56-57
• 第二章 对象、材料和方法57-76
• 2.1 研究对象57
• 2.2 主要设备和试剂57-61
• 2.3 实验方法61-75
• 2.4 统计学分析75-76
• 第三章 结果76-83
• 3.1 慢病毒转染验证76-77
• 3.2 Western Blot检测各组HPMEC中Notch1蛋白的表达77-79
• 3.3 Real-time PCR检测各组HPMEC中Notch1m RNA的表达79-81
• 3.4 Annexin V/PI双染法检测各组HPMEC凋亡率81-83
• 第四章 讨论83-85
• 第五章 结论85-86
• 第三部分Notch1通过ERK途径抑制肺微血管内皮细胞凋亡86-116
• 第一章 前言86-88
• 第二章 对象、材料和方法88-96
• 2.1 研究对象88
• 2.2 主要设备和试剂88-92
• 2.3 实验方法92-95
• 2.4 统计学分析95-96
• 第三章 结果96-113
• 3.1 Real-time PCR检测CSE对HPMEC中ERK1、ERK2m RNA表达的影响96-98
• 3.2 Western Blot检测CSE对HPMEC中ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达的影响98-100
• 3.3 Real-time PCR检测过表达Notch1对HPMEC中ERK1、ERK2m RNA表达的影响100-102
• 3.4 Western Blot检测过表达Notch1对HPMEC中ERK、ERK2蛋白表达的影响102-105
• 3.5 Real-time PCR检测抑制ERK对HPMEC中Notch1m RNA表达的影响105-107
• 3.6 Western Blot检测抑制ERK对HPMEC中Notch1蛋白表达的影响107-111
• 3.7 Annexin V/PI双染法检测抑制ERK对HPMEC凋亡的影响111-113
• 第四章 讨论113-115
• 第五章 结论115-116
• 参考文献116-126
• 综述一126-135
• 参考文献131-135
• 综述二135-160
• Reference146-160
• 攻读学位期间主要的研究成果160-161
• 致谢161

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本文编号：951342