HuR和miR-890转录后调控急性呼吸窘迫综合征炎症介质ICAM-1、HMGB1的机制研究

发布时间：2017-10-07 05:36

  本文关键词：HuR和miR-890转录后调控急性呼吸窘迫综合征炎症介质ICAM-1、HMGB1的机制研究

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【摘要】：急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是常见临床危重症,治疗手段缺乏。严重感染和创伤等多种诱因导致细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion Molecule 1, ICAM-1)、高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein 1, HMGB1)大量释放,形成炎症风暴,活化多种炎症细胞,进而诱导更多炎症因子释放,形成失控的级联放大式炎症反应,最后导致大量炎症细胞在肺部聚集和活化、血管内皮和气道上皮屏障水肿、增厚、破坏。在发生ARDS时,内皮细胞、上皮细胞表面的ICAM-1表达增多,导致大量中性粒细胞在肺部浸润、血管通透性增加,促进急性呼吸窘迫综合征的发展。HMGB1作为内源性信号分子,又称为损伤相关分子模式(Danger associated molecular pattern, DAMP)是一种重要的警报素,参与细胞信号转导,在炎症反应中发挥促炎作用。虽然ICAM-1、HMGB1的异常表达参与急性呼吸窘迫综合征的发生,但其调控机制仍不明确。RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)和microRNA是两种常见的转录后调控方式,可通过结合在mRNA的3’端非翻译区调控基因表达。ICAM-1和HMGB1的3’端非翻译区均存在RNA结合蛋白HuR可以作用的AU元件。此外,不同诱因导致ARDS患者外周血中microRNA谱发生显著变化,生物信息学预测表明miR-890与HMGB1存在结合可能性。但HuR和miR-890对呼吸窘迫综合征两种重要的炎症介质ICAM-1和HMGB1的转录后调控机制有待进一步探索。本研究探索HuR和miR-890转录后调控急性呼吸窘迫综合征炎症介质ICAM-1、HMGB1的机制,将为临床防治多种诱因导致的ARDS提供通用治疗靶点。第一部分HuR转录后调控急性呼吸窘迫综合征炎症介质ICAM-1机制研究目的：探讨p38-MAPK-MK2-HuR途径是否参与了TNF-α诱导的人肺微血管内皮细胞表达粘附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin及IL-8,是否进而影响中性粒细胞对血管内皮细胞的粘附。方法：收集ARDS患者外周血,检测血清中粘附因子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表达量；体外培养人肺微血管内皮细胞,给予TNF-α刺激,检测HuR蛋白和ICAM-1 mRNA结合情况：通过MK2-pcDAN3.1(+)和HuR-pcDAN3.1(+)质粒上调人肺微血管内皮细胞内MK2.HuR蛋白表达后,给予TNF-α刺激,检测MK2、HuR、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-8 mRNA和蛋白表达水平；观察HuR细胞内定位情况；观察健康人外周血分离的中性粒细胞对血管内皮细胞的粘附情况。本实验用到的实验方法有电泳凝胶迁移实验、RNA结合蛋白免疫沉淀、蛋白印迹、细胞浆-胞核蛋白提取、免疫荧光、酶联免疫吸附,实时定量PCR和放线菌素D实验及中性粒细胞粘附实验。结果：46例ARDS患者外周血中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表达增高；电泳凝胶迁移实验、RNA结合蛋白免疫沉淀证实HuR与ICAM-1 mRAN 3'UTR区域相结合;蛋白印迹和免疫荧光结果显示MK2促进了胞浆中HuR聚集,对胞核HuR表达无影响；HuR高表达增加了]NF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1表达,但对E-selectin和IL-8释放无影响：HuR提高了ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平和稳定性,但对E-selectin和IL-8 mRNA水平和稳定性无影响：HuR高表达增强了中性粒细对人肺微血管内皮细胞的粘附功能。结论：ARDS患者外周血sICAM-1、sVCAM-1和E-selectin表达增高。MK2通过改变HuR亚细胞定位调控粘附因子ICAM-1、VCAM-1的表达；HuR通过与ICAM-1 mRAN 3'UTR区域相结合,增加ICAM-1 mRNA稳定性,促进ICAM-1蛋白表达,从而增强中性粒细胞对人肺微血管内皮细胞的粘附作用；但HuR对E-selectin和IL-8释放无影响。第二部分miR-890转录后调控急性呼吸窘迫综合征炎症介质HMGB1的机制研究目的：探究miR-890转录后调控急性呼吸窘迫综合征炎症介质HMGB1的机制。方法：收集肺部感染、腹腔感染和胰腺炎等所致ARDS患者外周血,行酶联免疫吸附实验检测HMGB1水平；将3例肺部感染所致ARDS及健康对照者血清,通过Affymetrix microRNA 4.0 Array芯片检测人源2578种microRNA表达,得到差异性变化microRNA。将上述表达存在显著差异的microRNA分别通过Target Scan Human、miRanda和RNA22 v2 microRNA target detection 3个在线靶基因预测数据库预测,得到其中可能与HMGB1存在潜在结合位点的microRNA。结合Target Scan及miRanda预测数据库Context score分值排名,采用排名位于前3名的microRNA与HMGB1质粒行荧光素酶报告基因实验,筛选出能抑制HMGB1表达的microRNA,并在46例ARDS患者血清中进一步扩大验证其表达含量;同时,在LPS刺激的内皮细胞系(肺微血管内皮细胞、脐静脉内皮细胞)、肺泡上皮细胞系(HBE、A549)中验证该microRNA表达情况。在人肺微血管内皮细胞中给予microRNA模拟物,验证是否能调控HMGB1的mRNA和蛋白表达：给予上述条件下,给予细胞LPS刺激,检测炎症因子、趋化因子、粘附因子及TLR2、TLR4信号通路表达情况。行电泳凝胶迁移实验验证HuR与HMGB1 mRNA 3'UTR区域是否结合。结果：46例ARDS患者外周血清中HMGB1水平明显升高；肺部感染所致ARDS患者血清microRAN芯片检测结果示,45种microRNA在肺部感染所致ARDS患者与成年健康人血清中呈现显著差异性表达。miR-890为下调的microRNA,下调0.48倍。LPS刺激血管内皮细胞和气道上皮细胞后,细胞中miR-890水平降低。3种生物信息学软件预测microRNA与HMGB1结合情况,13种microRNA有可能与HMGB1 mRNA结合。结合Target Scan、miRanda、RNA22数据库预测情况,miR-890、miR-106a-3p和miR-140-3p.1这三种miRNA与HMGB1 mRNA3'UTR结合的可能性排名靠前。行双荧光素酶报告基因实验结果示3种microRNA中仅miR-890 mimics转染293 T细胞后致使荧光素酶活性降低。对HPMEC细胞转染miR-890mimics能抑制HMGB1蛋白及mRNA表达;给予LPS刺激后,miR-890 mimics转染组炎症因子IL-1β、IL-6、L-8、TNF-α,趋化因子MCP-1、RNATES,粘附因子ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平较对照组减少,TLR2、TLR4信号通路激活减少。HMGB1 mRNA 3'UTR区域多处存在AU序列,电泳凝胶迁移实验示HuR可与HMGB1 mRNA 3'UTR区域结合。结论：ARDS患者血清中循环miR-890水平明显降低；LPS刺激血管内皮细胞和气道上皮细胞后,细胞中miR-890水平降低：miR-890通过与HMGB1 3'UTR区域结合,抑制HMGB1 mRNA及蛋白分子表达,在LPS刺激时削弱炎症因子、趋化因子、粘附因子表达,TLR2、 TLR4信号通路激活减少。HuR通过与HMGB1 mRNA 3'UTR区域结合,稳定HMGB1 mRNA3’UTR,与miR-890起到竞争作用。
【关键词】：HuR ICAM-1 人肺微血管内皮细胞 中性粒细胞粘附 MK2 p38 MAPK HMGB1 miR-890 人肺微血管内皮细胞 转录后调控 炎症
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 中英文缩略词表7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-15
• 绪论15-24
• References20-24
• 第一部分 HuR转录后调控急性呼吸窘迫综合征炎症介质ICAM-1的机究研究24-72
• 引言24-32
• 一、材料与方法32-51
• 二、结果51-63
• 三、讨论63-65
• 四、结论65-66
• 参考文献66-72
• 第二部分 miR-890转录后调控急性呼吸窘迫综合征炎症介质HMGB1的机制研究72-110
• 引言72-77
• 一、材料与方法77-87
• 二、结果87-101
• 三、讨论101-104
• 四、结论104-105
• 参考文献105-110
• 全文总结110-111
• 附录111-141
• 一、研究综述文章111-136
• References122-136
• 二、试剂配制136-139
• 三、引物与探针序列139-140
• 四、博士期间完成文章列表140-141
• 致谢141-142

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本文编号：987243