巨噬细胞微粒通过激活MAPK信号通路诱导THP-1细胞产生IL-8

发布时间：2017-10-08 15:32

  本文关键词：巨噬细胞微粒通过激活MAPK信号通路诱导THP-1细胞产生IL-8

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【摘要】：目的:巨噬细胞微粒是介导慢阻肺、糖尿病、慢性肾病等病发病的重要病因。目前研究已得知,巨噬细胞微粒引起的过度炎症反应导致的免疫损伤是其致病的主要原因,但是巨噬细胞微粒引起过度炎症反应的具体发病机制尚不明确。本实验研究旨在探讨巨噬细胞微粒能否诱导人单核细胞(THP-1)产生炎症因子IL-8,以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在巨噬细胞微粒诱导THP-1细胞产生炎症因子IL-8的过程中的作用,进一步探讨巨噬细胞微粒的致病原理。方法:参照Nakamura和Yang SR的方法,用注射器连续抽吸收集2支完全燃烧的香烟的烟雾,随后将烟雾慢慢注射到不含血清的20ml培养基中,得到浓度为10%的香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)溶液。THP-1细胞用含佛波酯(PMA)的培养基处理24h后再用含2.5%的CSE的培养基刺激20h,随后收集微粒并作流式细胞术检测。分别用103、104、105、106/ml的巨噬细胞微粒处理已被用含佛波酯(PMA)的培养基刺激24h的THP-1细胞,分别在0h、3h、6h、12h、24h停止刺激。收集细胞后ELISA方法检测IL-8。105/ml的巨噬细胞微粒处理已被用含PMA的培养基刺激24h的THP-1细胞,分别在0min,15min,30min,60min停止刺激。Western blotting方法分别检测ERK1/2、JNK、p38的磷酸化程度。分别用1μM、10μM、30μM的p38特异性抑制剂SB203580、JNK特异性抑制剂SP600125、ERK1/2特异性抑制剂PD98059预处理已被PMA刺激的THP-1细胞,30min后再用105/ml巨噬细胞微粒刺激THP-1细胞12h,并用ELISA方法分析不同抑制剂对IL-8产生的影响。结果:(1)用含2.5%的CSE的培养基培养经PMA处理的THP-1细胞20h后,能明显诱导THP-1细胞产生巨噬细胞微粒。(2)ELISA结果表明,不同浓度组的巨噬细胞微粒都能明显刺激THP-1细胞产生IL-8。细胞上清中IL-8含量随微粒处理浓度的增加表现为逐渐升高的趋势,当微粒浓度为105/ml时达到最高。在同一浓度组间,随着处理时间的递增,IL-8的含量逐渐升高,在12h时IL-8产生最多,随后下降。(3)WB图片表明,巨噬细胞微粒处理THP-1细胞后p38/MAPK、JNK和ERK1/2/MAPK的磷酸化水平都较对照组升高,并且随着巨噬细胞微粒处理时间的递增p38/MAPK、JNK和ERK1/2/MAPK的磷酸化水平逐渐升高,三条通路的磷酸化程度基本都在处理THP-1细胞30min后升为最高。(4)ELISA检测结果表明:分别用1μM、10μM、30μM的p38特异性抑制剂SB203580、JNK特异性抑制剂SP600125、ERK1/2特异性抑制剂PD98059预处理THP-1细胞后,巨噬细胞微粒刺激THP-1细胞产生的IL-8含量都较未使用时降低,并且与抑制剂的浓度呈剂量依赖性。当三种特异性抑制剂浓度为30μM时,IL-8含量分别降到31.3%、46.1%和51.4%。结论:(1)香烟烟雾可诱导THP-1细胞产生巨噬细胞微粒;(2)巨噬细胞微粒可诱导THP-1细胞产生前炎症因子IL-8;(3)巨噬细胞微粒可激活ERK1/2/MAPK、JNK/MAPK和p38/MAPK通路,活化的ERK1/2/MAPK、JNK/MAPK和p38/MAPK通路可能与巨噬细胞微粒诱导前炎症细胞因子IL-8的产生有关。
【关键词】：香烟烟雾提取物 巨噬细胞微粒 丝裂原活化蛋白激酶 IL-8
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 主要中英文缩写12-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 实验材料18-22
• 2.1 实验主要仪器18
• 2.2 实验细胞18
• 2.3.实验试剂及溶液配制18-22
• 2.3.1 主要实验试剂配置18-19
• 2.3.2 主要实验溶液配制19-22
• 第三章 实验方法22-30
• 3.1 人单核细胞（THP-1 细胞）培养22-23
• 3.1.1 THP-1 细胞培养22
• 3.1.2 细胞计数22
• 3.1.3 细胞传代22
• 3.1.4 细胞冻存22-23
• 3.1.5 细胞复苏23
• 3.2 巨噬细胞微粒制备和分离23-24
• 3.2.1 香烟烟雾CSE原液制备23
• 3.2.2 佛波酯活化处理23
• 3.2.3 香烟烟雾提取物处理 THP-1 细胞23-24
• 3.2.4 巨噬细胞微粒收集24
• 3.3 探讨巨噬细胞微粒对THP-1 细胞的影响24-28
• 3.3.1 巨噬细胞微粒作用组24-28
• 3.3.2 MAPK特异性抑制剂作用组28
• 3.4 统计学分析28-30
• 第四章 实验结果30-39
• 4.1 100nM佛波酯诱导THP-1 细胞活化贴壁观察30
• 4.2 CSE处理活化的THP-1 细胞后细胞形态的变化30-31
• 4.3 酶联免疫分析（ELISA）检测巨噬细胞微粒诱导THP-1 细胞产生IL-8 的情况31-33
• 4.4 western blotting检测巨噬细胞微粒处理THP-1 细胞后对MAPK活化的影响33-36
• 4.5 酶联免疫分析（ELISA）检测抑制剂处理后，，巨噬细胞微粒诱导THP-1 细胞产生IL-8 的情况36-39
• 第五章 讨论39-43
• 第六章 结论43-45
• 参考文献45-49
• 研究生期间发表的论文49-51
• 致谢51

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