人C-反应蛋白（CRP）基因的克隆及表达研究

发布时间：2017-10-20 05:37

  本文关键词：人C-反应蛋白（CRP）基因的克隆及表达研究

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【摘要】：C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)参与人体炎症反应,是临床诊断中的重要检测指标。家蚕杆状病毒表达系统有高效表达和翻译后修饰的功能,可规模化生产,是外源重组蛋白理想的表达系统,本研究尝试利用该系统表达重组人CRP蛋白。通过设计特异引物,以人的肝组织c DNA为模板,扩增CRP目的基因,连接到p ColdTMII载体上,构建了重组p ColdTMII-CRP表达载体,转化至E.coli BL21(DE3)中,诱导工程菌获得包涵体蛋白,经包涵体溶解,Ni-NTA柱纯化,复性得到原核表达的重组人CRP蛋白,经过SDS-PAGE,Western Blot鉴定,以及质谱分析可以确定蛋白成功表达。以原核表达的重组人CRP为抗原,免疫新西兰大耳兔,首次以弗氏完全佐剂免疫,一周后以弗氏不完全佐剂加强免疫,每周一次连续免疫四周,最后一次免疫前ELISA检测抗血清效价,达到目的效价一周后颈动脉取兔全血,离心得抗CRP血清,ELISA检测抗体效价在抗原浓度10μg/m L时抗血清效价达到1:64000。得到CRP多克隆抗体,Western Blot检测得到目的条带,可用于后续的研究中。PCR得到CRP目的基因,酶切连接到p Fast BacTMHTB转移载体,得到重组p Fast BacTMHTB-CRP转移载体,利用Bac-to-Bac系统转化到E.coli Bm DH10Bac中,筛选出重组Bacmind-CRP。转染Bm N细胞,5 d左右细胞发病,得到重组杆状病毒v Bm His-CRP。扩增病毒接种到家蚕Bm N细胞中,并穿刺接种五龄的家蚕幼虫,在家蚕Bm N细胞和五龄的家蚕幼虫中均检测到目的蛋白。为获得廉价的重组产物,故选择在家蚕体内表达,SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白,发现重组人CRP蛋白在沉淀中,引入信号肽的重组病毒同样表达包涵体,因此按照纯化大肠杆菌包涵体的办法纯化家蚕体内的重组人CRP蛋白,得到目的蛋白,表达产量略低且有少许杂蛋白。用自制的CRP多克隆抗体Western Blot检测得到目的条带,质谱检测确定该蛋白为重组人CRP蛋白。这为家蚕生物反应器规模化制备重组人CRP蛋白打下了基础,解决了临床CRP相关炎症反应快速诊断试剂盒中标准抗原的来源问题。
【关键词】：C-反应蛋白(CRP) 杆状病毒 家蚕 多克隆抗体 Western Blot
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R392
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 缩略语8-13
• 第一章 绪论13-18
• 1 C-反应蛋白的概念13-14
• 1.1 C-反应蛋白（CRP）的发现和命名13
• 1.2 CRP的生物化学和生理学特性13-14
• 2 CRP的疾病相关性研究14-17
• 2.1 CRP蛋白与脑血管疾病相关性研究14
• 2.2 CRP蛋白与中风相关性研究14-15
• 2.3 CRP蛋白与类风湿性关节炎的相关性研究15-16
• 2.4 CRP蛋白与主动脉壁内血肿的相关性研究16
• 2.5 CRP与晚发阿尔兹海默症相关性研究16
• 2.6 CRP与肺炎的相关研究16-17
• 3 家蚕杆状病毒表达系统研究17-18
• 第二章 实验方案设计18-20
• 1 研究目的及意义18
• 2 研究内容18-19
• 3 实验流程图19-20
• 第三章 人CRP基因的生物信息学分析20-24
• 1 序列和工具20
• 1.1 序列20
• 1.2 生物信息学工具20
• 2 人CRP蛋白的生物信息学分析结果20-23
• 2.1 人CRP蛋白的基因序列20
• 2.2 人CRP蛋白信号肽分析20-21
• 2.3 人CRP蛋白跨膜区域预测21
• 2.4 人CRP蛋白疏水性分析21-22
• 2.5 人CRP蛋白的二级结构预测22-23
• 2.6 人CRP蛋白的高级结构预测23
• 3 讨论23-24
• 第四章 人CRP基因的克隆、原核表达与纯化24-36
• 1 材料与试剂24-25
• 1.1 材料24
• 1.2 试剂24
• 1.3 试剂配制24-25
• 2 方法25-31
• 2.1 重组质粒的构建25-29
• 2.2 重组质粒pColdTM II-CRP在BL21(DE3)中表达29-30
• 2.3 CRP融合蛋白纯化30
• 2.4 BCA法蛋白定量30-31
• 2.5 CRP的质谱检测31
• 3 结果31-35
• 3.1 PCR扩增人CRP基因31
• 3.2 重组pBluescript II SK(+)-CRP的菌落PCR鉴定31-32
• 3.3 重组质粒pColdTM II-CRP的菌落PCR鉴定32
• 3.4 重组CRP的原核表达32-33
• 3.5 亲和层析纯化重组蛋白33-34
• 3.6 原核表达CRP蛋白样品浓度34
• 3.7 质谱分析结果34-35
• 4 讨论35-36
• 第五章 人CRP蛋白多克隆抗体的制备36-40
• 1 材料和试剂36
• 1.1 材料36
• 1.2 试剂36
• 2 制备方法36-38
• 2.1 免疫抗原的制备36
• 2.2 动物免疫36-37
• 2.3 制备兔多克隆抗血清37
• 2.4 ELISA法检测抗体效价37
• 2.5 Western Blot检测抗体的特异性37-38
• 3 结果38-39
• 3.1 多克隆抗体的效价38
• 3.2 Western Blot检测结果38-39
• 4 讨论39-40
• 第六章 家蚕杆状病毒系统表达人C-反应蛋白40-54
• 1 材料与试剂40
• 1.1 材料40
• 1.2 试剂40
• 2 方法40-47
• 2.1 构建pFastBacTMHTB-CRP重组载体40-41
• 2.2 重组质粒与Bacmid同源重组41-43
• 2.3 重组病毒vBmHis-CRP的构建43-45
• 2.4 重组人CRP蛋白在家蚕BmN细胞中的表达和鉴定45
• 2.5 重组人CRP蛋白在家蚕五龄幼虫体内的表达及鉴定45-46
• 2.6 五龄蚕体内CRP融合蛋白的纯化46
• 2.7 BCA法蛋白定量46
• 2.8 重组CRP的质谱检测46-47
• 3 结果47-53
• 3.1 扩增CRP基因片段结果47
• 3.2 重组质粒的菌落PCR47-48
• 3.3 重组Bacmid DNA PCR鉴定48-49
• 3.4 重组病毒vBmHis-CRP鉴定结果49
• 3.5 家蚕细胞中表达重组人CRP蛋白的结果49-51
• 3.6 家蚕蚕体中重组人CRP蛋白的鉴定结果51
• 3.7 家蚕体内重组人CRP蛋白的纯化和定量51-52
• 3.8 纯化的重组蛋白质谱检测分析52-53
• 4 讨论53-54
• 小节54-55
• 参考文献55-58
• 致谢58

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 谭淑敏;李杰;王小飞;舒特俊;陈剑清;张耀洲;于威;;人血清对氧磷酶1在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及活性检测[J];蚕业科学;2014年03期

2 潘晶晶;潘华晔;严珍珍;叶甫云;张耀洲;吕正兵;;利用家蚕杆状病毒表达系统表达葡萄白藜芦醇芪合酶基因[J];药物生物技术;2014年02期

3 闫晶晶;张耀洲;陈剑清;于威;舒特俊;;家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV的RBD蛋白及其免疫原性研究[J];浙江理工大学学报;2014年11期

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1 闫晶晶;家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV N、RBD蛋白及其免疫原性研究[D];浙江理工大学;2014年

2 梅文枫;PCR产物快速构建重组杆状病毒的方法及相关功能蛋白的研究[D];浙江理工大学;2014年

3 赵文年;小反刍兽疫西藏07株H、F、M、P蛋白在昆虫细胞中的表达[D];新疆农业大学;2014年

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本文编号：1065536