人短链TSLP启动子区的克隆鉴定及功能分析

发布时间：2024-07-11 00:17

　　目的:构建人短链胸腺基质淋巴生成素(short isoform thymic stromal lymphopoietin,sfTSLP)启动子全长及其长度不等片段的萤光素酶报告质粒,以确定启动子活性区域并预测功能性转录因子结合位点。方法:使用按基因组序列设计的引物,通过PCR分离人sf TSLP启动子片段,并将之插入萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中。通过步移缺失构建其截短片段,通过双萤光素酶报告基因系统测定所有启动子缺失克隆在HEK-293细胞中的活性,并使用生物信息学手段预测其潜在的转录结合位点。结果:经菌液PCR、双酶切、测序,成功构建了人sfTSLP启动子及其截短片段萤光素酶报告质粒,并确定其启动子活性区域位于5′侧翼区-200～+25 nt区域内,且可能含有SP1/SP3、SPI1/SPIB、TCF3、ETS1等转录因子结合位点。结论:首次对人sfTSLP启动子区进行了研究,初步确定了其启动子活性区域及可能的转录因子结合位点,为更进一步的研究指明了方向。

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【部分图文】：

图2人sfTSLP启动子萤光素酶报告基因重组质粒双酶切鉴定

图1pTSLP-1质粒构建与验证2.2近端启动子区缺失质粒的构建

图3人sfTSLP启动子荧光素报告基因重组质粒在HEK-293细胞中相对萤光素酶活性

根据上述人TSLP启动子重组质粒的萤光素酶活性检测结果分析，提示-200～+25nt区域内可能存在明显影响启动子活性的转录因子结合位点，应用JARSPAR对该区域进行分析，获得可能的转录因子结合位点。如图4所示，预测结果提示该序列范围内可能存在SPI1、SPIB、SP1/SP3....

图4运用JASPAR网站预测转录因子结合位点

图3人sfTSLP启动子荧光素报告基因重组质粒在HEK-293细胞中相对萤光素酶活性3讨论

图1pTSLP-1质粒构建与验证

选取6个生长良好的单克隆菌落扩大培养，并进行菌液PCR验证，所提质粒经MIUⅠ及XhoⅠ双酶切后电泳，可见2条特异性片段，1条约5000bp即pGL3-basic载体片段，另1条片段大小约为2000bp，与目的片段大小相同（图1B）。核酸序列测定结果提示，此片段核苷酸序列....

本文编号：4004950