TSG-6对HCMV感染引起的TNF-α和IL-6表达水平下调的研究

发布时间：2017-11-01 03:17

  本文关键词：TSG-6对HCMV感染引起的TNF-α和IL-6表达水平下调的研究

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【摘要】：目的检测人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染细胞后肿瘤坏死因子α刺激基因-6 (tumor necrosis factor a stimulated gene 6,TSG-6)的表达情况；研究TSG-6对HCMV感染所致炎症反应的作用及其对核转录因子NF-κB (nuclear factor-kappaB,NF-KB)核定位的改变,为HCMV的免疫逃逸机制和HCMV所致的炎症性疾病治疗提供新的思路。方法(1)在人胚成纤维细胞中增殖HCMV并通过PCR, IFA及电镜观察对其进行鉴定,后通过空斑形成实验测定病毒滴度。(2)用HCMV(MOI=2)感染人胚肺成纤维细胞(MRC-5)和视网膜上皮细胞(ARPE-19),并设正常细胞对照组和灭活病毒感染组。在病毒感染后的第24h、48 h、72h、96h和第120h提取总RNA及蛋白,采用RT-qPCR和Western Blot检测各组不同时间点TSG-6 mRNA和蛋白表达水平,检测TSG-6是否参与HCMV所致的炎症反应过程。(3)将重组人TSG-6蛋白(recombinant human TSG-6 protein, rhTSG-6) 100 ng/mL作用于HCMV感染的MRC-5细胞作为rhTSG-6干预组,设正常细胞对照和病毒对照组。在病毒感染的第24h、48h、72h、96h和第120h收集各组细胞培养物上清,采用ELISA方法检测各组细胞培养物上清中TNF-a和IL-6表达水平,检测TSG-6对HCMV诱导产生的炎性因子的抑制作用。(4)与病毒对照相比,在rhTSG-6作用6h后,用IFA检测NF-κB核定位情况,用Western Blot检测rhTSG-6作用24h、48h、72h、96h、120h后NF-κB蛋白表达水平,探讨TSG-6对HCMV感染引起的NF-κB核定位改变的影响。结果(1)病毒感染细胞后,出现明显的病毒致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),表现为细胞肿胀变圆,折光性增强；PCR对HCMV AD169株UL83、UL86两种基因扩增,均出现特异性条带；IFA检测HCMVpp65抗原阳性,荧光显微镜下出现苹果绿绿荧光信号；透射电镜下观察到典型的HCMV形态特征。(2) RT-qPCR结果显示,MRC-5细胞在病毒感染后的第72 h时,TSG-6mRNA表达明显升高,约为细胞对照组的19倍(tD=17.12,P0.01)；第96h达到高峰,约为细胞对照的376倍(tD373.15,P0.01)；第120 h时开始下降,约为细胞对照组的113倍(tD=111.25,P0.01)。ARPE-19细胞在病毒感染后第96h开始出现TSG-6mRNA的明显表达,约为细胞对照组的15倍(tD14.25,P0.01),感染后第120 h约为细胞对照组的354倍(tD=352.42,P0.01)细胞对照组和灭活病毒感染组TSG-6mRNA表达量极少,且随着时间变化不明显。Western Blot结果证实,TSG-6蛋白在相应时间点也随之升高。(3) rhTSG-6作用于HCMV感染的MRC-5细胞后与病毒对照组相比,细胞培养物上清中TNF-α、IL-6水平明显下降(p0.05)。(4)免疫荧光检测结果显示rhTSG-6干预组NF-κB核移位减弱；Western Blot对rhTSG-6 (100g/mL)干预组的检测结果发现,NF-κB p65蛋白表达与各时间点病毒对照组的NF-κB p65蛋白表达相比明显减弱(P0.01)。结论(1)TSG-6参与HCMV引起的炎症反应过程,在HCMV感染后期呈现高表达；(2)TSG-6能下调HCMV引起的相关炎性因子的表达；(3)TSG-6对HCMV引起的NF-κB核移位具有抑制作用。
【关键词】：人巨细胞病毒 肿瘤坏死因子α刺激基因-6 核转录因子-κB
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 材料和方法13-27
• 结果27-34
• 讨论34-38
• 不足之处及下一步计划38
• 结论38-39
• 参考文献39-43
• 附录一：个人简历43-44
• 附录二：致谢44-45
• 附录三：综述45-55
• 参考文献52-55

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本文编号：1125000