大肠杆菌O157:H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价

发布时间：2017-11-02 05:22

  本文关键词：大肠杆菌O157:H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价

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【摘要】：目的:制备高效价、高纯度、特异性好、荧光强度高及稳定的抗大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体,初步探讨其在大肠杆菌荧光免疫检测试验中的应用。方法:复苏培养E.coli O157∶H7标准菌株,甲醛灭活制备疫苗免疫家兔。4次免疫后,颈动脉采血分离血清,经辛酸-饱和硫酸铵法粗提后应用蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行IgG纯化,借助SDS-PAGE电泳、BCA试剂盒法、间接ELISA法分别对蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价进行测定。应用不同FITC与蛋白量比值以及不同标记反应条件对多克隆抗体进行标记。比较荧光抗体F485/535,结合差异性显著分析对FITC与蛋白量比值及反应条件进行合理选择,应用标记抗体与E.coli O157∶H7和金黄色葡萄球菌混合菌液反应验证标记效果。结果:HiTrap Protein G进行E.coli O157∶H7多克隆抗体纯化的最佳纯化方法为35%、100%二梯度洗脱,制备抗体效价为1∶25 600,与沙门氏菌、阴沟肠杆菌等8种肠杆菌无交叉反应,最佳FITC与蛋白量比值为1∶10,最佳标记反应条件为20℃、2h。由最佳条件制得的荧光抗体与E.coli O157∶H7反应明显,强荧光连续照射15min后仍显示高亮度荧光反应,且不与金黄色葡萄球菌反应。结论:本实验首次制备出纯度高、荧光强度高、持续时间长的E.coliO157:H7FITC标记多克隆抗体,为E.coli O157:H7荧光免疫检测方法的建立完成了关键步骤。
【作者单位】： 吉林大学军需科技学院食品质量与安全教研室;吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室;吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心;
【关键词】： 大肠杆菌O∶H 多克隆抗体 荧光免疫 异硫氰酸荧光素
【基金】：国家质检总局科技项目资助课题(2010IK018)
【分类号】：R378
【正文快照】： O157∶H7是大肠杆菌中重要血清型,其感染剂量极低,一次摄入10个活菌就可致病[1]。因此,做好食品中E.coli O157∶H7的检测具有重要的意义。微生物检测方法很多,包括细菌培养法、聚合酶链式反应(PCR)法及酶联免疫吸附法等,但均有不足之处[2-5]。免疫荧光技术(immunof1uorescence

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本文编号：1130173