氟他胺诱导大鼠干眼模型的实验研究

发布时间：2017-11-07 13:18

  本文关键词：氟他胺诱导大鼠干眼模型的实验研究

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【摘要】：干眼是由于泪液的质和(或)量或流体动力学异常引起的泪膜不稳定和(或)眼表损害,从而导致眼部不适症状及视力障碍的一类疾病。是目前发病率最高的眼表疾病之一,但其发病机制比较复杂,目前认为主要与炎症、性激素水平失调、神经调节机制异常、细胞凋亡等因素相关。其中性激素在干眼的发病过程中起着重要的作用。近年研究表明雄激素在干眼症发病机制中具有较为肯定的作用,能够改善泪腺萎缩,促进泪腺细胞增殖,缓解眼表损害,改善泪膜稳定性,保护泪腺免于炎症刺激。研究已证实雄激素受体存在于睑板腺、泪腺以及角结膜等处。氟他胺为非甾体类抗雄激素药物,除抗雄激素作用外,本品无任何激素的作用。其代谢产物小羟基氟他胺是主要活性形式,能在靶组织内与雄激素受体结合,阻断二氢睾丸酮(雄激素的活性形式)与雄激素受体结合,抑制靶组织摄取睾酮,从而起到抗雄激素作用。干眼动物模型是研究干眼发病、发展的重要手段,根据干眼不同的发病机制建立合适的动物模型是实验研究的基础,但未见使用雄激素受体拮抗剂制作干眼模型的报道。炎症在干眼病的发生发展中扮演着至关重要的角色,但是国内外有关应用抗雄激素药物导致的干眼症与眼表炎症因子关系的研究较少。因此,本研究拟通过制作雄激素受体拮抗剂氟他胺诱导的大鼠干眼模型,观察大鼠泪液分泌量、泪膜稳定性、眼表组织病理学变化；通过免疫组织化学方法检测肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-1α(interleukin-1α, IL-1α)在角膜、结膜、泪腺和睑板腺上皮的表达,探讨雄激素受体拮抗剂氟他胺导致干眼的发病机制,分析该模型的科学性及实用性,并为干眼的治疗提供理论依据。第一部分氟他胺诱导大鼠干眼模型的建立目的建立雄激素受体拮抗剂氟他胺诱导的大鼠干眼动物模型,为进一步探讨雄激素在干眼发病机制中的作用提供基础。方法清洁级健康成年SD雌性大鼠32只,采用随机数字表法分为高浓度组、中浓度组、低浓度组和对照组,每组各8只。高、中、低浓度组分别用浓度为16mg·kg-1·d-1、13mg·kg-1·d-1、10mg·kg-1·d-1氟他胺溶液灌胃,对照组1ml·d-1生理盐水灌胃,每组分别于给药前和给药后2、4、8、16、20周测干眼临床指标：泪液分泌试验(Schirmer I test, S I t)、泪膜破裂时间(tear firm break-up time, BUT)及角膜荧光素钠染色评分。造模成功标准：给药后20周时高、中、低浓度组大鼠的干眼临床指标与对照组比较差异均有统计学意义。每组分别于给药前、给药后10、20周行心脏穿刺取血,采用放射免疫法测量血清睾酮及雌二醇浓度。使用SPSS19.0统计学软件数据分析,描述性统计值用X±S表示,P0.05为差异有统计学意义。结果1. Schirmer I test:给药后4周时高浓度组(8.20±0.58mm)、中浓度组(8.53±0.34mm) S I t值开始减少,与对照组(9.84±0.54mm)比较差异有统计学意义(P0.05)；8周时高浓度组(7.13±0.25mm)、中浓度组(7.04±0.47mm)、低浓度组(8.43±0.67mm)的SIt值均少于对照组(9.94±0.43mm)(P0.05)；随着时间延长,20周时高浓度组(3.23±0.31mm)、中浓度组(3.98±0.36mm)、低浓度组(4.73±0.18mm)的SIt值进一步减少,两两比较差异均有统计学意义(P0.05),且均较对照组(9.60±0.60mm)下降大于50%(P0.05)。2.BUT：给药后4周时高浓度组(6.80±1.05s)大鼠即出现BUT缩短,分别与低浓度组(8.63±0.65s)、对照组(9.25±1.03s)比较差异有统计学意义(P0.05)；8周时,高浓度组(5.20±0.58s)、中浓度组(7.21±0.56s)、低浓度组(8.32±0.37s)的BUT两两比较差异有显著统计学意义(P0.05),且均短于对照组(10.70±1.07s)(P0.05)；20周时高(2.40±0.61 s)、中(4.32±0.68s)、低(6.10±0.81s)浓度组的BUT较对照组(9.12±0.73s)进一步缩短,各组之间两两比较差异均有显著统计学意义(P0.05)。3.角膜荧光素钠染色：给药后4周时高、中浓度组开始出现角膜上皮点状荧光素钠着色；8周时角膜荧光素钠染色评分高浓度组(6.80±0.79)、中浓度组(4.13±0.53)分别与低浓度组(2.50±1.08)、对照组(0.56±1.30)比较差异有统计学意义(P0.05)；16周时高浓度组可见弥漫性大片状着色,中、低浓度组角膜上皮出现小片状着色,随时间延长高、中、低浓度组角膜荧光素钠染色评分逐渐加重,20周时高浓度组(9.05±0.49)、中浓度组(7.21±0.57)、低浓度组(4.82±0.47)、对照组(1.05±1.13)染色评分两两比较差异均有统计学意义(P0.05)。4.性激素水平：给药后10周时高浓度组(4.38±0.68pg·ml-1)、中浓度组(3.56±0.53pg·ml-1)的血清睾酮浓度开始升高,分别与对照组比较差异有显著统计学意义(P0.05)；20周时高浓度组(5.08±0.21pg·ml-1)、中浓度组(4.23±0.16pg·ml-1)、低浓度组3.58±0.24pg·ml-1)血清睾酮浓度较对照组(2.24±0.15pg·ml-1)不同程度升高,两两比较差异有显著统计学意义(P0.05)。给药后10、20周时高、中、低浓度组血清雌二醇浓度较对照组均无明显差异(P0.05),各组之间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论雄激素受体拮抗剂氟他胺溶液灌胃可以成功建立混合型干眼模型,且干眼的严重程度呈时间和药物浓度依赖性。第二部分氟他胺诱导大鼠干眼模型的机制研究目的探讨氟他胺诱导大鼠干眼模型的作用机制。方法实验动物及分组同第一部分。20周后麻醉下处死各组动物,取角膜、结膜、泪腺和睑板腺组织HE染色观察各上皮病理组织变化,并采用免疫组织化学方法检测’TNF-α、IL-1α在各组织上皮的表达。每张切片选取5个200倍视野进行拍照,并用Image-Pro Plus分析软件对照片进行阳性细胞计数,使用SPSS19.0统计学软件数据分析,描述性统计值用X±S表示,TNF-α、IL-1α的表达量用单因素方差分析(One-Way ANOVA), P0.05为差异有统计学意义。结果1.角膜组织病理学观察：高、中、低浓度组角膜出现不同程度鳞状上皮层次明显增加,排列紊乱且可见表层细胞不规则缺失,翼状细胞及基底细胞排列紊乱,基质层水肿,高浓度组病变最显著。对照组角膜上皮细胞层次正常较扁平,表层细胞不角化,翼状上皮细胞呈多角形,基底细胞排列整齐。2.泪腺组织病理学观察：高、中、低浓度组出现不同程度泪腺上皮细胞扁平萎缩小而密集、胞浆淡染,可见空泡,细胞排列紊乱,腺腔扩大。腺泡萎缩融合,大小不一,结构排列紊乱,高浓度组改变最为显著。对照组可见结缔组织深入实质将腺组织分割成小叶,边界清晰而规则的腺泡细胞大小均匀,内层是柱状上皮细胞,核位于基底部。3.结膜组织病理学观察：高、中、低浓度组出现不同程度结膜上皮细胞层数增多,层次间模糊,排列紊乱呈角化状,基底层细胞排列不整齐,可见炎性细胞浸润。对照组结膜上皮细胞排列规则,无角化及炎性细胞浸润。4.睑板腺组织病理学观察：高、中、低浓度组出现不同程度险板腺腺体萎缩融合,鳞状上皮化生,腺管壁增厚,基底细胞变薄,腺管周围纤维化和腺管开口扩张。对照组险板腺可见边界清晰而规则的腺细胞,大小均匀排列整齐,腺管呈一同心圆状,管壁厚度正常。6.角膜中TNF-α、IL-1α的表达：免疫组化结果显示高、中、低浓度组TNF-α、IL-la大量表达于角膜上皮细胞胞浆及少量表达于基质层,对照组微量表达。高、中、低浓度组每1000个角膜上皮细胞中TNF-α、IL-1α阳性表达的细胞数明显高于对照组(P0.05)。高、中浓度组角膜上皮TNF-α、IL-1α的阳性细胞数相对低浓度组较高(P0.05)。7.泪腺中TNF-α、IL-1α的表达：免疫组化结果显示高、中浓度组TNF-α、IL-la大量表达于泪腺腺泡上皮细胞胞浆,低浓度组可见中量表达,对照组少量表达。高、中、低浓度组每1000个泪腺细胞中TNF-α、IL-1α阳性表达的细胞数明显高于对照组(P0.05)。高、中浓度组泪腺上皮TNF-α的阳性细胞数相对低浓度组较高(P0.05),但高、中浓度组间比较,差异无显著统计学意义(P0.01)。高、中、低浓度组的IL-1α阳性细胞计数组间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。8.睑板腺中TNF-α、IL-1α的表达：免疫组化结果显示高、中、低浓度组TNF-α、IL-1a大量表达于睑板腺腺泡细胞胞浆,对照组少量表达。高、中、低浓度组每1000个睑板腺腺泡细胞中TNF-α、IL-1α阳性表达的细胞数明显高于对照组(P0.05)。高、中浓度组TNF-α、IL-1α的阳性细胞计数相对低浓度组较高(P0.05),但高、中浓度组间比较,差异无显著统计学意义(P0.01)。9.结膜中TNF-α、IL-1α的表达：免疫组化结果显示高、中、低浓度组TNF-α、IL-la大量表达于结膜上皮细胞胞浆,微量表达于固有层,对照组少量表达于结膜上皮细胞胞浆。高、中、低浓度组每1000个结膜上皮细胞中TNF-α、IL-1α阳性表达的细胞数明显高于对照组(P0.05)。高、中、低浓度组TNF-α的阳性细胞计数组间比较,差异均有统计学意义(P0.01)。高浓度组IL-1α的阳性细胞计数相对低浓度组较高(P0.05),但高、中浓度组以及中、低浓度组间比较,差异均无显著统计学意义(P0.01)。结论1.氟他胺能引起大鼠角膜、泪腺、睑板腺、结膜组织的病理学改变,且病理改变程度与给药浓度呈正相关。2.氟他胺诱导大鼠干眼与TNF-α、IL-1α在角膜、泪腺、睑板腺、结膜组织的表达增加有关。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332;R777.34

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本文编号：1152572