骨髓间充质干细胞动脉靶向移植对兔急性肾小管坏死模型的治疗研究

发布时间：2017-11-10 03:23

  本文关键词：骨髓间充质干细胞动脉靶向移植对兔急性肾小管坏死模型的治疗研究

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【摘要】：目的：掌握实验兔急性肾小管坏死模型的建立与自体骨髓间充质干细胞的获取、制备和培养方法。采用经肾动脉靶向灌注移植兔自体骨髓间充质干细胞,与未治疗对照组比较,观察移植后的骨髓间充质干细胞对缺血再灌注损伤引起的急性肾小管坏死的修复作用及其对肾功能恢复的影响。为骨髓间充质干细胞移植治疗急性肾小管坏死的临床应用推广提供实验依据。方法：1、实验兔自体骨髓间充质干细胞的获取与培养：8只健康日本大耳白兔,体质量2±0.5Kg,随机分成两组(BM-MSCs移植组和对照组),每组各4只;模型建立前所有实验兔均采血行血肌酐、尿素氮检测并记录。在模型建立后24h移植组与对照组各随机选1只兔处死,切除肾脏行病理学观察。移植组其余3只兔在无菌条件下采集骨髓各5ml,以贴壁培养法分离自体BM-MSCs并进行原代及传代培养,培养过程中进行细胞形态学观察。随机选取其中一瓶P2代细胞做(4,6-联脒-2-苯基吲哚4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记并在显微镜下观察。2、建立实验兔急性肾小管坏死模型：采用缺血再灌注损伤机制建立模型。全部实验兔在无菌静脉麻醉状态下,开腹钝性分离双侧肾动脉,采用无损伤血管钳夹闭双肾动脉90min,观察肾脏变化(包括体积、颜色、外观形态等),去夹恢复肾动脉血流灌注。模型建立后24h,对照组及移植组各随机选取1只实验兔处死并取肾组织,病理学观察肾小管坏死情况；建立模型后3小时、24小时检测血肌酐和尿素氮水平并记录。通过观察血生化指标变化与病理学改变,确定肾小管坏死模型建立成功。3、动脉靶向灌注兔自体骨髓间充质干细胞并与对照组对比观察：(1)移植组(3只)：麻醉下开腹分离腹主动脉下段(约齐双侧髂总动脉分叉部上方)采用Sel dinger穿刺技术,插入3F Progreat微导管约5cm至肾动脉开口水平,缓慢灌注兔自体BM-MSCs悬液2ml/kg,退微导管及导管鞘,穿刺点采用可吸收性无损伤缝合线缝合,待无出血、渗血后逐层关腹。(2)对照组(3只),与移植组在同一时间点,经腹股沟内侧静脉缓慢注入等量生理盐水作对比组观察。(3)两组间对比观察：移植BM-MSCs术后,两组分别于3d、5d、7d采血检测血肌酐、尿素氮,对比分析两组间差异。7d后移植组实验兔在麻醉状态下,用10%的甲醛行双侧肾脏灌注固定后取材,对标本行冰冻切片并在荧光显微镜下观察干细胞归巢情况。结果：1、BM-MSCs的扩增培养：3只移植组获取骨髓,细胞接种24h后可见少量细胞贴壁;3-4d后可见细胞集落形成。5-7d可见细胞铺满瓶底,达到融合状态,可进行传代培养。第3代以后,细胞分裂活跃,细胞形态呈成纤维状改变,大部分呈长梭状。2、实验兔肾缺血再灌注损伤模型建立后,病理学观察显示肾小管上皮细胞均有不同程度变性、坏死。动脉移植BM-MSCs后7d,荧光显微镜下可观察到经DAPI标记的BM-MSCs沉积于肾组织。3、兔急性肾小管坏死模型建立前血肌酐(x±s)103.88±8.11 μmol/L,尿素氮(x±s)8.79±0.75mmol/L。模型建立后,分别于3h、24h采血观察：血肌酐及尿素氮水平明显倍增,分别为3h 211.75±14.52 μmol/L及18.71±1.20mmol/L；24h 339.63±26.36μmol/L及24.06±2.56mmol/L。模型建立前与模型建立后3h、24h比较,差异有统计学意义(P0.05)。4.BM-MSCs移植后通过采血检测分析,移植后3d移植组血肌酐、尿素氮水平与对照组比较无统计学意义(P0.05)。移植后第5d起移植组血肌酐、尿素氮水平均低于对照组,组间差异有统计学意义(P0.05)。第7d动脉组血肌酐、尿素氮分别为116.33±12.50 μ mol/L和10.13±2.78mmol/L显著低于对照组243.67±17.21 μmol/L和17.62±1.47mmol/L,差异有统计学意义(P0.05)。结论：1、实验兔采用夹闭双肾动脉90min后恢复血流再灌注,能快速成功的建立急性缺血性再灌注损伤后急性肾小管坏死模型。2、经动脉内插管灌注的BM-MSCs可向损伤肾组织归巢,且在移植7天后DAPI仍保持荧光特性。3、BM-MSCs行动脉内插管早期靶向移植可以有效改善急性缺血性再灌注损伤后急性肾小管坏死肾功能的恢复。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332;R699.2

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本文编号：1164875