SLPI基因敲除和敲入小鼠细胞模型的建立及SLPI促进U2OS细胞迁移的分子机制研究

发布时间：2017-11-13 13:41

  本文关键词：SLPI基因敲除和敲入小鼠细胞模型的建立及SLPI促进U2OS细胞迁移的分子机制研究

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【摘要】：第一部分SLPI基因敲除和敲入小鼠细胞模型的建立牙齿发育是一个长期复杂的过程,是上皮间充质相互诱导的结果。包括牙胚的发生、形成、细胞的分化、基质分泌和矿化等几个阶段。现在牙齿的形态发育已经基本研究清楚,但在分子机制方面,仍有很多待我们探索。SLPI为粘膜上皮细胞分泌的非糖基化单链多肽蛋白,包含107个氨基酸的单链多肽,属于乳清酸性蛋白家族。SLPI由两段高度同源性的,富含半胱氨酸区和C末端区组成,C末端区具有抑制弹性蛋白酶活性的作用,N末端区有抗菌、抗逆转率病毒和抗炎活性。虽然牙齿受伤会诱导成牙本质细胞表达SLPI,然而SLPI如何参与牙齿发育尚未见有人报道。其在牙本质发育过程中有什么作用?通过什么样的分子机制实现?机制研究需要动物和细胞模型,本论文第一部分主要是建立SLPI基因沉默和SLPI基因过表达的动物和细胞模型,为下一步研究SLPI在牙齿发育中作用及其机制做好铺垫。实验内容和结果：1、通过分子生物学实验方法,构建鼠源SLPI基因过表达载体pCMV6-SLPI(+)-GFP;2、通过经典育种与PCR相结合的方法,进行SLPI基因过表达纯合子小鼠的建系；3、原代培养了SLPI基因野生型牙胚细胞和SLPI基因敲除的牙胚细胞。后续的实验主要是,完成SLPI基因过表达小鼠的纯合子验证,原代培养SLPI基因过表达的牙胚细胞,通过western blot和免疫组化研究SLPI基因在牙齿发育中的作用及其机制。第二部分SLPI促进U20S细胞迁移的分子机制研究随着生态环境的恶化和生活方式的不健康,癌症发病率逐年上升,现已成为威胁人类健康的头号杀手。现在癌症治疗方法主要有,手术切除、放疗、化疗。但这些治疗方法仍无法克服肿瘤细胞耐药性的产生和转移的发生。我们通过前期实验发现SLPI具有促进成牙本质细胞迁移的能力,并推测出了其可能的作用通路。另有文献报道,很多肿瘤细胞发生迁移时,体内SLPI高表达,但机制还未研究清楚。因此我们推测促进成牙本质细胞迁移的SLPI在肿瘤细胞的迁移中也发挥着一定的作用,因此通过SLPI基因过表达来确定SLPI促进肿瘤细胞转移的机制,通过SLPI基因沉默来确定SLPI是否降低肿瘤细胞的迁移及其机制。本论文选取肿瘤中在青少年中较为高发的骨肉瘤作为研究对象,通过构建SLPI基因过表达细胞系和SLPI基因沉默模型,并用ERK1/2抑制剂U0126处理,来探究SLPI基因是否通过激活ERK1/2信号路径促进肿瘤细胞的迁移,SLPI基因沉默SLPI是否通过抑制ERK1/2信号通路降低肿瘤细胞的迁移。实验内容和结果：1、构建人源SLPI基因过表达的载体pCMV6-SLPI-GFP,并将pCMV6-SLPI-GFP和pCMV6-AC-GFP转染U20S细胞,然后挑选单克隆培养成稳定表达的单克隆细胞系；2、通过PCR和western blot实验,确定了siRNA干扰的U20S细胞内源性SLPI表达的最佳条件；3、通过细胞迁移实验,初步确认了SLPI基因过表达促进U20S细胞迁移,SLPI基因沉默降低U2OS细胞迁移；4、通过明胶酶谱和western blot实验初步验证了我们猜测的通路。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R33

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