电生理研究中小鼠离体脊髓切片方法的改良

发布时间：2017-11-18 23:26

  本文关键词：电生理研究中小鼠离体脊髓切片方法的改良

  更多相关文章： 运动神经元 动作电位 离体活脊髓切片 人工脑脊液 膜片钳全细胞记录模式

【摘要】：通过膜片钳全细胞记录模式记录有功能的完整脊髓切片的方法已经成为一个重要的工具来研究神经网络结构。这种技术要比通过细胞培养的方法测定运动神经元的电活动有明显的优势。最近科学家用分子遗传学的方法可以鉴定神经元的群落,随后发现这些群落可以自发电活动,这对于研究神经网络结构以及机制是非常重要的[1]。如果这项技术可以发展成熟,这对于生理学以及解剖学都会带来巨大的收益。由于该技术方法难度较大,近年采用脊髓离体膜片钳技术的实验报道并不多。实验困难主要集中在脊髓片制备过程中,如脊髓为细长型,解剖时间长,不易固定在切片机上;脊髓神经纤维多且排列紧密不易快速平整切断;脊髓神经元(尤其是运动神经元)对离体损伤的耐受性差等。因此改良实验方法,找到一种快速易行且神经元存活率高的脊髓片制备技术,是深入研究脊髓神经网络电活动的基础。目的:由于制备活的脊髓切片所需时间长,脊髓前角运动神经元细胞体积大,切片过程中容易受损,对环境改变的耐受力差,细胞的的存活率低,为了在活的离体脊髓切片上研究运动神经元的电生理以及神经网络结构,本研究通过改良离体活脊髓切片的制备方法,从而减小对脊髓的损伤,缩短脊髓切片的时间,增加脊髓神经元细胞的存活率。方法:制备离体脊髓切片前首先需制备好人工脑脊液及2%琼脂块。将ACSF分成两份,一份放入于玻璃瓶中然后将玻璃瓶放入冰块中制备0℃的人工脑脊液,另一份置于烧杯中然后将烧杯放入水浴箱中。通入制备好的95%O_2和5%CO_2混合气30分钟,充分饱和。用刀片切下长约1cm宽约0.5cm高约0.7cm琼脂块,在长边正中开垂直半圆形凹槽,用于固定脊髓。传统制备脊髓切片的方法是取出生8~12天的C57BL/6J近交系小鼠用水合氯醛麻醉后置于冰袋上5min,使小鼠的代谢率下降,更好的保持其细胞的活力。迅速断头,用眼科剪沿脊上正中切口切开皮肤,暴露脊柱。剪断两侧肋骨及周围软组织,取出整条脊柱迅速置于预先制备好的冰的人工脑脊液中。在解剖显微镜下行椎板切除术,沿背正中线由骶髓向上至胸髓逐个椎骨切开,从切口用显微镊仔细分开椎骨暴露脊髓,之后使用显微镊夹住胸髓端,轻轻上提,用显微剪剪断脊髓双侧神经根,取出附着有蛛网膜和软膜的脊髓,在冰ACSF中撕去脊髓表面的蛛网膜和软膜,并修整为适当的大小,将制备好的腰髓放在凹槽内,将琼脂块连同脊髓粘贴于切片盒内。使用振动切片机沿脊髓水平方向做厚度为450μm切片。将标本置于95%O_2和5%CO_2混合气饱和的ACSF中水浴箱34℃孵育60分钟备用。本实验取出生8~12天的C57BL/6近交系小鼠,麻醉后迅速端头剪断两侧肋骨及周围软组织,取出整条脊柱迅速置于预先制备好的冰的ACSF中,去掉颈髓保留至胸段至L5以上组织,尽量修剪干净椎骨两旁组织,用带有200ul塑料吸液头的的5ml注射器吸入人工脑脊液,从尾侧椎孔内向上吹出脊髓,用显微手术剪剪下腰髓。将制备好的腰髓放在凹槽内,将琼脂块连同脊髓粘贴于切片盒内。使用振动切片机沿脊髓水平切面方向做厚度为450μm切片。将标本置于95%O_2和5%CO_2混合气饱和的ACSF中水浴箱34℃孵育60分钟备用。用膜片钳全细胞记录模式,将电压钳制在-65~70mv,分别给予0p A、50p A、100p A及150p A阶梯状电流刺激持续500ms,每个刺激间隔为1s,记录脊髓前角运动神经元的动作电位。结果:经过反复的实验我们发现经过1个月左右才能够熟练掌握椎板切开术后取出脊髓,制备脊髓切片,而经过10天左右时间就可以熟练掌握椎孔内注射人工脑脊液法取出脊髓制备脊髓切片。改良的法方可以比采用椎板切开术取出脊髓的方法更容易掌握,对脊髓的损伤小,取出的脊髓更完整。改良后制备脊髓切片所用的时间比椎板切开术制备的脊髓切片所用的时间明显缩短。传统采用椎板切开的方法制备脊髓切片所用的时间为25.60±2.51分钟,改良后采用椎孔内注射人工脑脊液的方法制备脊髓切片所用的时间为8.60±1.14分钟,两种方法制备脊髓切片所用的时间经t检验比较P0.01,有统计学意义。改良后制备的脊髓切片中前角运动神经元的数目比椎板切开术制备的脊髓切片前角运动神经元的数目明显增多。椎板切开的方法制备脊髓切片中脊髓前角运动神经元存活的数目为3.00±1.58个,采用椎孔内注射人工脑脊液的方法制备的脊髓切片中脊髓前角运动神经元存活的数目为8.20±0.84个,两种方法制备脊髓切片中脊髓前角运动神经元存活的数目经t检验比较P0.01,有统计学意义。经测定C57小鼠脊髓运动神经元的阈电位平均为-54.2±6.1mv,振幅平均为37.7±8.7mv,单个动作电位时间平均为2±0.3 ms,动作电位上升的速率平均为148.6±4.8mv/ms,动作电位下降的速率平均为-65.6±7.6mv/ms。结论:采用椎孔注射人工脑脊液的方法制备的脊髓切片手术时间短,取出的脊髓更完整,细胞存活的数目多。改良的方法比椎板切开的方法有明显的优点。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R338

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本文编号：1201562