人类细小病毒B19基因组NS1、VP1和VP2基因克隆及对宿主Ⅰ型干扰素信号通路的影响研究

发布时间：2017-11-30 06:36

  本文关键词：人类细小病毒B19基因组NS1、VP1和VP2基因克隆及对宿主Ⅰ型干扰素信号通路的影响研究

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【摘要】：背景人类细小病毒B19 (Human parvovirus B19)是在1975年被首次发现的直径只有23nnm的无包膜单链DNA病毒,主要通过呼吸道、血液、血液制品以及母婴垂直传播,呈全球性分布,春季是发病高峰期。在宿主感染B19病毒后,宿主首先产生IgM,这种免疫球蛋白可以持续大约3个月的时间,感染两周后,宿主可以产生IgG,这种免疫球蛋白可以在宿主体内持续终生。B19病毒的基因组主要包含三个开放阅读框：NS1、VP1和VP2。本实验室前期研究了B19病毒在我国献血人群中的流行率,但是关于B19病毒对宿主固有免疫,特别是Ⅰ型干扰素信号通路的作用还没有相关研究。目的在Hela细胞系中高表达NS1、VP1和VP2,研究高表达目的基因对于宿主生成内源性干扰素以及对于宿主Ⅰ型干扰素信号通路的影响。方法通过基因克隆将NS1、VP1和VP2分别克隆到表达载体pcDNA3.1-3tag上形成pcDNA3.1-3tag-NS1、pcDNA3.1-3tag-VP1和pcDNA3.1-3tag-VP2重组质粒。将重组质粒转染至Hela细胞,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR,RT-PCR)以及免疫印迹(Western Blot, WB)的实验方法分别检测目的基因在mRNA和蛋白水平的表达。在确认目的基因可以在蛋白水平高表达后,我们通过RT-PCR检测目的基因对于宿主细胞生成内源性干扰素以及ISGs表达的影响；通过WB检测目的基因对STAT1磷酸化的影响；通过双荧光报告基因检测目的基因对ISRE活性的影响。结果成功克隆了NS1、VP1和VP2的重组质粒,均能在细胞mRNA水平高表达,但只有NS1可以在蛋白水平高表达。转染NS1后可以促进细胞生成内源性干扰素,干扰素刺激后,NS1可以在STAT1磷酸化、ISRE活性以及ISGs表达三个层次抑制细胞Ⅰ型干扰素信号通路。结论NS1可以激活宿主固有免疫,刺激宿主细胞生成Ⅰ型干扰素,可以在p-STAT1、 ISRE活性和ISGs表达三个层次抑制Ⅰ型干扰素信号通路。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373

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本文编号：1238345