抗TNF-α骆驼化人源sdAbs库的构建及筛选

发布时间：2017-12-09 07:20

  本文关键词：抗TNF-α骆驼化人源sdAbs库的构建及筛选

  更多相关文章： 骆驼化抗体 人源抗体 单域抗体 肿瘤坏死因子α

【摘要】：目的探索有效的抗体稳定性改构策略,筛选制备抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)稳定、高亲和力人源抗体。方法基于定点突变技术和核糖体展示技术,对人源抗体片段VH进行骆驼化稳定性改构,构建骆驼化人源单域抗体(single-domain antibodyies,sdAbs)库,以TNF-α作为筛选抗原,筛选特异骆驼化人源sdAbs。结果以前期构建的人源VH/K基因库为模板扩增VH基因;采用定点突变方法,将VH基因FR2中的4个疏水性氨基酸突变为亲水性氨基酸构建人源骆驼化sdAbs基因库;基于核糖体抗体库技术,构建用于核糖体展示的sdAbs基因库;经体外转录翻译后,以重组TNF-α作为筛选抗原,采用亲和富集法淘选特异性抗体基因;将筛选富集mRNA的RT-PCR基因产物克隆,并在原核系统pET-22b(+)/BL21(DE3)中实现可溶性表达,表达产物经ELISA鉴定,确认具有极高ELISA值的阳性克隆12、40,其序列分析表明是全新的抗TNF-α人源sdAbs;抗原特异性结合活性实验显示两者均可以特异性识别TNF-α,而不能与狂犬病毒糖蛋白和BSA结合,表明它们是特异针对TNF-α的人源基因工程抗体,而且均有很好的抗原浓度依赖性。结论该研究将抗体稳定性的定向改造法和进化方法相结合,筛选得到了具有较好抗原特异性和良好稳定性的人源抗体,为稳定性人源抗体的制备提供了理论依据及技术基础。
【作者单位】： 天津医科大学生物医学工程学院;军事医学科学院卫生学环境医学研究所;解放军254医院;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(31070823,31270986) 天津市自然科学基金重点资助项目(11JCZDJC20800)
【分类号】：R392
【正文快照】： 肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是具有多种生物学活性的细胞因子,对多种疾病的发生、发展及转归具有重要影响。抗TNF-α抗体是治疗TNF-α过量表达介导的炎症性疾病的理想方法[1,2]。基因工程抗体由于相对分子质量小,易于构建和表达,是近年来抗体工程研

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 赵小玲;荫俊;陈伟强;杨冠;张素娟;;人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段基因的构建与表达[J];解放军医学杂志;2006年02期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 赵小玲;陈伟强;李静梅;张素娟;田露芳;王亮;弓景波;杨志华;;应用核糖体展示技术筛选制备抗TNF-α人源抗体的研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2009年02期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 邹佳;抗人脂多糖结合蛋白二硫键稳定性Fv抗体的构建表达及生物学活性的初步研究[D];第三军医大学;2006年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 赵小玲,荫俊;人源抗狂犬病毒单链抗体基因原核表达质粒的构建及高效表达[J];生物技术通讯;2004年02期

2 赵小玲,荫俊,王慧,姜明,侯小军;人源抗狂犬病毒单链抗体库的构建及体外亲和筛选[J];细胞与分子免疫学杂志;2004年02期

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘金波;邓华聪;葛倩;李丙蓉;郑宏庭;兰丽珍;;脂联素对TNF-α介导的血管炎症反应的影响[J];第四军医大学学报;2006年18期

2 郜宇;陈丽;;TNF-α诱导血管内皮细胞凋亡的研究[J];医学综述;2007年17期

3 吴丽娜;刘勇;;重组杀菌渗透性增加蛋白21在大鼠内毒素血症中保护机制的探讨[J];中国医科大学学报;2008年01期

4 张召锋;赵明;王军波;戴小倩;丁叶;李勇;;肿瘤坏死因子-α诱导大鼠L6细胞胰岛素抵抗模型的建立[J];卫生研究;2010年02期

5 宋艳芳;祝先进;林青;何凤屏;李山;梁驰;;IFN-γ和TNF-α对甲状腺细胞凋亡的诱导作用[J];临床检验杂志;2010年03期

6 于永利;杨贵贞;;以cRNA为内在参照物测定人支气管肺泡洗出液细胞TNFα mRNA的含量[J];中国免疫学杂志;1992年02期

7 李茂,高军,龙建秋,吴晓兰;自制阳离子脂质体介导的体内外基因转移研究[J];海军医学杂志;2005年02期

8 朱启昒,俞慧,顾绍庆,王建设,葛艳玲,谢新宝;干扰素γ和肿瘤坏死因子α基因单核苷酸多态性与宫内乙肝病毒感染易感性研究[J];临床儿科杂志;2005年07期

9 蔺静,姚咏明,黄志红,侯晓霞,于燕,盛志勇;CD14-159C/T基因多态性对全血培养CD14表达的影响[J];中华外科杂志;2005年15期

10 孙开宏,颜军;中小负荷运动对心理应激大鼠血清 TNF-α和 IL-1β的影响[J];中国心理卫生杂志;2005年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 马丽;柴家科;申传安;;肿瘤坏死因子α致骨骼肌细胞凋亡的体外研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

2 王霞;周江睿;蒋春雷;;NPY对巨噬细胞肿瘤坏死因子α产生的调节及机制的初步研究[A];中国生理学会消化内分泌生殖代谢生理专业委员会2011年消化内分泌生殖学术会议论文摘要汇编[C];2011年

3 李洁;李秀钧;陈国弟;辛军平;;B049.肿瘤坏死因子α启动子基因多态性与循环瘦素、神经肽Y、肿瘤坏死因子水平[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年

4 宋卫青;吕维红;陈华波;;肿瘤坏死因子α致体外肝细胞凋亡效应的研究[A];第四届全国临床检验学术会议论文汇编[C];2006年

5 李长菲;刘秋燕;陈伟;李楠;王丽;王玉珍;曹雪涛;;一种新型凋亡蛋白EAPF促进肿瘤坏死因子α诱导的内质网相关的细胞凋亡[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

6 常宏;秦卫松;冯健男;黎燕;沈倍奋;;新型TNF-α抗体的研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

7 段岩;李杰;陶杰;游洋;栾波;刘少伟;张效林;闫承慧;韩雅玲;;E1A激活基因阻遏子对抗肿瘤坏死因子α引起的血管内皮细胞炎性损伤[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年

8 张福强;王斗斗;马杰;丛登立;宿晓云;;通用人源抗体筛选、表达体系的构建[A];科技创新与节能减排——吉林省第五届科学技术学术年会论文集（下册）[C];2008年

9 袁钻宁;窦非;;人源噬菌体抗体库的构建及抗Aβ寡聚体抗体的筛选[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年

10 王长军;唐家琪;李先富;潘秀珍;操敏;;抗人红细胞血型A抗原噬菌体单链抗体的研究[A];中国输血1999年年会暨纪念ABO血型发现100周年学术交流论文专辑[C];1999年

中国重要报纸全文数据库 前7条

1 胡德荣;沪建立首个SARS人源抗体基因库[N];中国医药报;2003年

2 记者 李天舒;抗狂犬病毒人源抗体制备成功[N];健康报;2011年

3 记者 骆红初;隔离SARS与人体“第三者”露面 全球首个人源抗体基因库建成[N];上海科技报;2003年

4 张忠霞;两种阻断非典病毒的人源抗体被发现[N];医药经济报;2007年

5 ;抗体研发期待突破[N];中国医药报;2002年

6 记者汪敏华;申城建成首个抗体基因库[N];解放日报;2003年

7 张中桥;“辐照血”可预防FNHTR发生[N];中国医药报;2004年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 方晨;Her2全人源抗体的制备及生物学功能研究[D];第二军医大学;2011年

2 付永锋;抗刚地弓形虫特异性人源抗体Fab片段的制备和研究[D];复旦大学;2008年

3 王会中;脂联素对小鼠免疫性肝损伤保护作用的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年

4 康晓平;抗SARS病毒人源Fab抗体的制备研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年

5 刘金也;隐孢子虫特异性人源抗体Fab片段的制备和研究[D];复旦大学;2006年

6 王辉;大容量天然噬菌体抗体库的建立、筛选及抗DR5抗体的鉴定[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年

7 高松;A类清道夫受体与葡萄糖调节蛋白78相互作用的研究[D];南京医科大学;2008年

8 严美娟;β-1，4-半乳糖基转移酶Ⅰ和Ⅴ在两型星形胶质和施万细胞中的生物学作用[D];苏州大学;2009年

9 刘梦元;抗TNF-α多价抗体的构建及体内外生物学活性研究[D];中国协和医科大学;2005年

10 梁文杰;猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究[D];第三军医大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 云云;Toll样受体3介导呼吸道合胞病毒感染的炎症反应[D];安徽医科大学;2007年

2 李祥云;肿瘤坏死因子-α在细菌脂多糖下调小鼠胎肝细胞色素P450 3A中的作用[D];安徽医科大学;2009年

3 苏幼红;从双峰驼单域抗体库中筛选蒜氨酸酶抑制活性抗体[D];新疆大学;2010年

4 乔媛媛;大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年

5 方丽;抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定[D];四川大学;2007年

6 姜南艳;HMGB1结构域和HMGB1A盒与LBPK95A融合基因的克隆表达及其生物学功能的初步研究[D];第四军医大学;2005年

7 焦晓阳;脑不对称影响神经免疫内分泌的细胞学基础[D];汕头大学;2005年

8 林福清;多器官功能障碍综合征患者中性粒细胞功能的变化[D];第二军医大学;2006年

9 王珍;甘氨酸拮抗内毒素性心脏损伤的作用及机制研究[D];暨南大学;2007年

10 李瑞;人胚胎心肌祖细胞的免疫原性[D];第二军医大学;2007年

，

本文编号：1269541