分泌型载脂蛋白E与丙型肝炎病毒颗粒的细胞外相互作用

发布时间：2017-12-12 15:06

  本文关键词：分泌型载脂蛋白E与丙型肝炎病毒颗粒的细胞外相互作用

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【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是丙型肝炎的病原体,严重威胁着人们的健康。对于HCV感染尚无有效的疫苗,临床上主要采用抗病毒策略进行治疗,但存在诸多问题。HCV疫苗的研发需要我们加深对病毒的基础研究以及其与宿主之间相互作用的认识。HCV的复制周期与宿主的脂代谢紧密相关,血液中的HCV病毒与脂蛋白等结合形成脂病毒颗粒(lipoviroparticles, LVPs),载脂蛋白E(apoE)作为LVPs的重要组成部分,在HCV病毒的复制周期中起到重要作用,但具体的作用机制尚不十分清楚。有研究通过RNA干扰技术下调Huh7.5细胞中apoE的表达使HCV病毒的感染性下调10-100倍,因此很多人认为apoE是HCV病毒感染复制所必需的蛋白。但是RNA干扰技术不能完全抑制蛋白的表达,因而不能完全确定apoE是否是HCV复制所必须的。本研究通过CRISPR/Cas9系统敲除Huh7.5细胞中apoE的表达,并采用HCV进行感染,通过Western Blot、IFA、 qRT-PCR、IHC分别炔病毒蛋白、RNA以及感染性滴度方面检测HCV病毒,说明apoE对HCV病毒的感染及复制并非是必需的；apoE在机体内主要由肝脏合成,并分泌到血液中,既存在于肝细胞内也存在于细胞外,研究认为apoE在细胞内与HCV结合进而在HCV的组装机释放过程中起重要作用,然而分泌至细胞外的apoE是否能与HCV结合一直未被证明,本研究通过转染表达分泌型的apoE-HA,并与HCV病毒进行免疫共沉淀,结果表明HCV病毒能够与分泌型的apoE在细胞外结合,同时对加入apoE的HCV进行滴度检测表明这种结合能够改变HCV病毒的感染性。由于HCV病毒颗粒能够与apoE结合,E1E2膜蛋白位于病毒颗粒表面,有研究通过构建含有E1E2蛋白的HCV假病毒颗粒(HCVpp)并研究其与apoE之间的相互作用,结果HCVpp能够与apoE发生相互作用,提示了HCV病毒颗粒通过膜蛋白E1E2与apoE发生相互作用。为了进一步探讨研究apoE与E1E2之间的结合,通过稳定转染细胞系分别表达E1、E2、E1E2蛋白并与分泌型apoE-HA进行免疫共沉淀,实验提示apoE与E1E2蛋白二聚体结合,与E1蛋白不发生结合,而与E2蛋白存在微弱的结合。E1E2膜蛋白是HCV疫苗研发中重要的抗原蛋白,与apoE的结合可能影响其免疫原性,为了确定E1E2蛋白进入机体能否被apoE结合,通过将E1E2与人血清进行免疫共沉淀,结果E1E2能够与人血清中apoE结合。我们希望进一步寻找与apoE结合的膜蛋白位点,然而通过哺乳动物细胞双杂交系统及免疫共沉淀实验进行探讨均未成功,还需要通过其他后续的实验方法进一步深入探讨与apoE结合的膜蛋白具体片段。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.21
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本文编号：1282929