马齿苋酰胺E对帕金森病模型的保护作用研究

发布时间：2017-12-16 00:16

  本文关键词：马齿苋酰胺E对帕金森病模型的保护作用研究

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【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是世界第二大神经退行性疾病。其主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经元的变性缺失导致纹状体内多巴胺含量减少；其临床表现为肌肉强直、静止性震颤、运动减少和步态异常。该病发病缓慢,呈进行性加重,严重削弱了病人的运动能力。左旋多巴是目前临床用于治疗帕金森病的常用药物,它可以补充多巴胺的不足从而缓解PD症状,但对神经细胞并无保护作用,长期服用甚至会产生较多副作用,因此治疗帕金森病的药物仍有待开发。马齿苋(Portulaca oleracea L.)为我国传统的药食两用植物,其具有凉血止血、清热解毒等功效,而且还具有抗氧化、抗老年痴呆、镇痛、抗焦虑、神经保护等多种药理作用。最新研究发现,马齿苋提取物可以改善鱼藤酮等多种神经毒剂诱导的PD动物模型的运动能力、抑制神经细胞凋亡、增加纹状体内多巴胺含量。但是,马齿苋提取物中抗PD药效物质基础尚不明确。马齿苋酰胺E (Oleracein E, OE)是本课题组从马齿苋中提取得到的四氢异喹啉生物碱,鉴于OE具有显著的抗氧化作用,对大剂量D-半乳糖／亚硝酸钠诱导的老年痴呆衰老小鼠模型具有缓解氧化应激、抗凋亡和神经保护作用,我们推测OE是马齿苋抗PD的活性成分之一。本文评价了OE对鱼藤酮诱导的PD细胞模型和动物模型的作用。(1)利用5 μM鱼藤酮致毒SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞24 h建立PD体外细胞模型,10μM OE预孵2 h再与鱼藤酮共孵育24 h,检测OE对鱼藤酮致毒PD细胞模型的作用。通过测定乳酸脱氢酶(LDH)逸漏率、(?)UNEL染色、DCFH-DA染色、JC-1染色,分别检测细胞的生存率、凋亡率、细胞内ROS水平以及线粒体膜电势；用免疫印迹法(western-blot)检测细胞ERK信号通路中MEK1/2和ERK1/2激酶以及凋亡相关蛋白bax、bcl-2、cytochrome c、cleaved caspase-3的表达。结果表明,与空白对照组相比,5 μM鱼藤酮处理24 h后,SH-SY5Y细胞的LDH逸漏率显著增加(p0.001)、凋亡率显著上升(p0.001)、ROS水平显著升高(p0.001)、线粒体膜电势明显降低；与空白对照组比较,鱼藤酮处理1 h、12 h、24 h时ERK信号通路中总的ERK含量没有发生明显变化或略微有些降低,但p-MEK、p-ERK表达明显提高,在24 h时p-ERK表达具有显著性差异(p0.001)。此外,凋亡相关蛋白bax/bcl-2比率(p=0.005)、cytochrome c (p0.001)以及cleaved caspase-3 (p0.001)蛋白的表达都显著增强。与鱼藤酮模型组相比,10μMOE显著降低了细胞LDH逸漏率(p0.001)、细胞凋亡率(p0.001)以及细胞内ROS水平(p0.001),提高了细胞膜电势；在鱼藤酮处理1 h、12 h、24 h时,OE对p-MEK、p-ERK蛋白的表达都有抑制作用,在24 h时,对p-ERK蛋白表达的抑制作用最为显著(p=0.002),且显著抑制bax/bcl-2 (p=0.009)、cytochrome c (p=0.012)以及cleaved caspase-3 (p=0.003)蛋白的表达。(2)采用C57BL-6J小鼠灌胃给鱼藤酮(30 mg/kg/d)56天,建立了PD小鼠模型。药物处理组分别灌胃给予高剂量OE (15mg/kg/d)、低剂量OE (3 mg/kg/d)和阳性对照药盐酸司来吉兰(10mg/kg/d)56天。采用自发活动实验、转棒实验、步态实验检测小鼠的运动能力；测定小鼠中脑、纹状体和血浆中的SOD活力和MDA含量,评价小鼠的氧化应激水平；酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色观察小鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元；免疫印记法(western-blot)检测小鼠中脑和纹状体ERK激酶的表达。结果显示,与空白对照组相比,鱼藤酮模型组小鼠在自发活动实验中30 min内的运动距离显著减少(p=0.028)；在转棒上的运动时间显著减少(p=0.033)；步态试验中,小鼠的前后肢配合指数与同侧后足步幅显著性减小(p0.001),小鼠两后爪足掌距离(p=0.01)显著性增加；小鼠纹状体(p=0.031)和血浆(p0.001)中SOD活力显著降低,中脑SOD活力虽然降低,但差异不显著(p0.05)；中脑(p=0.005)、纹状体(p=0.045)和血浆(p0.001)中的MDA含量都显著增加；免疫组化染色显示小鼠中脑黑质致密部TH阳性细胞数(p=0.034)和TH阳性神经纤维光密度值(p0.001)显著性降低,树突明显变短或消失；此外,小鼠中脑(p=0.021)和纹状体(p0.001)p-ERK表达均显著升高。与鱼藤酮模型组相比,OE高剂量组小鼠的运动路程(p=0.001)、在转棒上的运动时间(p=0.024)、前后肢配合指数(p=0.011)以及同侧后足步幅(p=0.048)都显著增加,小鼠两后爪足掌距离减小但无显著性差异(p0.05)；小鼠中脑(p=0.007)、纹状体(p=0.022)和血浆(p0.001)中的SOD活力显著增强,MDA含量显著减少(p=0.005,p=0.015,p0.001)；小鼠中脑黑质致密部TH阳性细胞数(p=0.004)和TH阳性神经纤维光密度值(p=0.001)显著性升高,多巴胺能神经元树突增多；中脑(p=0.043)和纹状体(p=0.037)中p-ERK表达均显著减少, 但凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2无显著性变化(p0.05)。OE低剂量组小鼠与鱼藤酮模型组相比,其前后肢配合指数(p=0.02)、同侧后足步幅(p=0.016)都显著升高,两后爪足掌距离显著减小(p=0.005),小鼠中脑黑质致密部TH阳性细胞数(p=0.025)和TH阳性神经纤维光密度值(p=0.012)显著性升高;但其中脑及纹状体的生化指标以及p-ERK的表达没有显著性差异。司来吉兰阳性对照组可提高小鼠在转棒上的运动时间(p=0.029)、前后肢配合指数(p=0.025)、同侧后足步幅(p=0.029),降低两后爪足掌距离(p=0.004)；提高血浆SOD活性(p=0.002),降低血浆(p0.001)、中脑(p0.001)、纹状体(p=0.005)中的MDA含量,减少小鼠中脑神经元凋亡,显著性提高TH阳性神经纤维光密度值(p=0.009),但中脑和纹状体中p-ERK蛋白表达无显著性变化(p0.05)。以上实验结果表明,OE通过缓解小鼠氧化应激,抑制小鼠中脑多巴胺能神经元的损伤、提高小鼠运动能力,与阳性药物司来吉兰作用相似；但OE对ERK1/2磷酸化有显著抑制作用,与司来吉兰作用特点不同。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5;R-332

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