基于沙门菌鞭毛蛋白的H7N9亚型禽流感亚单位疫苗构建及其免疫应答特性

发布时间：2017-12-23 10:46

  本文关键词：基于沙门菌鞭毛蛋白的H7N9亚型禽流感亚单位疫苗构建及其免疫应答特性　出处：《扬州大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：自2013年3月,H7N9亚型禽流感病毒在我国传播,其高感染率以及不断提高的人传染人的可能性引起了全球关注。重组亚单位疫苗能对病毒感染提供安全、特异的免疫保护。但是,亚单位疫苗的免疫原性比传统疫苗(如灭活全病毒疫苗)弱,需要添加佐剂来增强其作用。研究表明细菌鞭毛蛋白具有很强的佐剂活性,可以促进抗原诱导高效的免疫应答。人感染H7N9亚型禽流感病毒病例不断地出现,迫使研究者们快速开发出安全有效的疫苗,尤其是黏膜亚单位疫苗,因为通过滴鼻免疫的疫苗不但能预防流感,还能在病毒感染的初始部位阻断病毒感染。1.H7N9亚型禽流感病毒血凝素HA1-2基因与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliC的融合表达及鉴定本研究利用overlap-PCR技术将H7N9亚型禽流感病毒血凝素球状部(HA1-2,aa 62-284)基因连接到鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因够iC)的N端,获得目的基因片段HA1-2-fliC(2187 bp),另外还单独扩增了HA1-2片段(669 bp)。将它们分别与pCold载体连接、转化,通过大肠杆菌表达系统表达出HA1-2-fliC和HA1-2蛋白。SDS-PAGE结果显示大肠杆菌表达系统能够成功表达出HA1-2-fliC和HA1-2,蛋白大小与预期一致。分别用抗fliC和抗H7N9亚型禽流感病毒的多抗血清对蛋白进行Western blotting分析,结果显示HA1-2-fliC和HA1-2均具有良好的免疫反应性。另外,TLR5生物活性试验显示,HA1-2-fliC能刺激HEK293-mTLR5细胞分泌高水平IL-8,说明HA1-2-fliC具有体外活化TLR5的生物功能,而HA1-2蛋白则不能。以上研究结果表明融合蛋白能正确折叠出HA1-2和fliC两部分的天然构象。2.腹腔注射免疫融合蛋白HA1-2-fliC诱导的免疫应答特性将HA1-2和HA1-2-fliC以腹腔注射方式免疫C3H/HeJ小鼠,间隔14和28天进行加强免疫,并设立PBS为阴性对照。在二免、三免12天分别采血,通过ELISA和HAI试验检测小鼠血清中的抗体水平。与HA1-2免疫组相比,HA1-2-fliC诱导出显著且强烈的血清IgG抗体应答,且在小鼠体内维持至少3个月。另外,我们检测了三免12天小鼠血清中的IgG亚型,结果表明融合蛋白能诱导产生相似水平的IgG1和IgG2a应答,均显著高于HA1-2免疫组,同时能诱导产生高水平的HAI抗体。综上所述,融合蛋白中的鞭毛蛋白能够显著提高HA1-2的免疫原性,促进HA1-2特异的免疫应答,融合蛋白可以成为一种有潜力的H7N9亚型禽流感亚单位疫苗候选株。3.滴鼻免疫融合蛋白HA1-2-fliC诱导的免疫应答特性为进一步评价鞭毛蛋白能否成为H7N9亚型禽流感亚单位疫苗的黏膜佐剂,以HA1-2和HA1-2-fliC滴鼻免疫C3H/HeJ小鼠,间隔14和28天进行加强免疫,并设立PBS为阴性对照,CTB佐剂作为阳性对照。检测三免12天后小鼠的体液、细胞和黏膜免疫应答。ELISA结果显示HA1-2-fliC能够显著提高小鼠血清及黏膜灌洗液(鼻腔和支气管肺泡灌洗液)中的IgG和IgA抗体水平。对于细胞免疫应答,我们检测了三免后12天小鼠脾脏淋巴细胞的增殖与细胞因子分泌情况。结果显示,与HA1-2免疫组相比,HA1-2-fliC能显著提高淋巴细胞的增殖和活化,促进IFN-y和IL-4的分泌,诱导产生Th1/Th2混合型免疫应答,这与IgG亚型的检测结果(与单独HA1-2免疫组IgG1/IgG2a比率类似)是一致的。本研究为H7N9亚型禽流感黏膜亚单位疫苗的进一步研究奠定了基础。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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本文编号：1323591