RNR2调控的重组绿色荧光蛋白酵母细胞的构建及其对化学诱变原的高通量筛选

发布时间：2017-12-23 13:04

  本文关键词：RNR2调控的重组绿色荧光蛋白酵母细胞的构建及其对化学诱变原的高通量筛选　出处：《中国药理学与毒理学杂志》2013年03期 　论文类型：期刊论文

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【摘要】：目的建立RNR2调控的酵母增强绿色荧光蛋白(yEGFP)发光酵母细胞,高通量筛选化学诱变原。方法用PCR方法从酵母(W303-1A)基因组扩增RNR2启动子,经酶切后,用T4连接酶与线性化的含酵母嗜好遗传密码子的yEGFP报告载体相连,连接产物转化子质粒经酶切和测序鉴定,构建RNR2调控的yEGFP酵母报告载体。用醋酸锂方法将其转化于W303-1A酵母细胞,从而构建成RNR2调控的yEGFP发光酵母细胞(W303-1A/RNR2-yEGFP)。用甲磺酸甲酯0～400mg·L-1分别作用于该发光酵母细胞0,4,8,12,16和20h后,于倒置荧光显微镜下观察荧光,用多功能酶标仪检测其荧光发光强度,选择最佳诱导时间;用不同浓度的DNA烷化剂、DNA断裂剂和DNA合成酶抑制剂作用于该重组细胞16h,检测其荧光发光强度,考察W303-1A/RNR2-yEGFP细胞对各种化学诱变原的敏感性。结果经测序确定W303-1A/RNR2-yEGFP构建成功。选择16h为最佳诱导时间;各种化学诱变原与W303-1A/RNR2-yEGFP细胞作用16h后,与DNA发生结合的化合物中放线菌素D和溴乙锭诱导的发光度与对照组无明显差别,发光倍数1.5;与DNA发生烷基化的化合物中,甲磺酸甲脂200mg·L-1诱导的细胞发光度最强,发光倍数为5.21,瘤可宁200μg·L-1诱导的发光倍数为1.9,而丝裂霉素C的发光度与对照组无明显差别。在使DNA发生断裂的诱变原中,顺铂250mg·L-1诱导的细胞最高发光倍数为3.7,其次4-硝基-N-氧化喹啉3.1mg·L-1、博来霉素12.5mg·L-1和福来霉素200mg·L-1,最高诱导倍数分别为2.35,2.26和2.53;在抑制DNA合成酶或拓扑异构酶的诱变原中,5-氟尿嘧啶500μg·L-1、羟基脲570.45mg·L-1和喜树碱30mg·L-1所诱导的细胞最大发光倍数分别为2.36,2.65和2.53;而非基因毒性化合物秋水仙碱、刀豆氨酸和四环素诱导的发光度与对照无明显差别。结论该重组发光酵母细胞可用于对多数造成DNA断裂或合成阻断的化学诱变原筛选,具有快速、方便和高通量等特点。
【作者单位】： 扬州大学医学院预防医学教研室;扬州大学动物科学与技术学院环境卫生学教研室;
【基金】：国家自然科学基金(81041111) 扬州大学2011年度大学生学术科技创新基金(B11142)~~
【分类号】：R341
【正文快照】： 核糖核酸还原酶(ribonucleotide reductase,RNR)是普遍存在于细菌、酵母、人细胞和其他细胞中的合成脱氧核糖核苷三磷酸的限速酶,是生物体内唯一的催化4种核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖核苷酸的酶,在细胞内DNA合成和修复过程中起关键作用[1]。虽然不同类型RNR之间的氨

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