miR-493通过靶向作用于MIF调控大鼠脑缺血模型的血管新生
本文关键词:miR-493通过靶向作用于MIF调控大鼠脑缺血模型的血管新生 出处:《华中科技大学》2016年博士论文 论文类型:学位论文
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【摘要】:目的:探讨miR-493对脑梗塞后血管新生的影响及其机制。方法:建立大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)模型,分别于梗塞后3天和7天应用实时荧光定量PCR检测梗塞周边miR-493的表达;侧脑室注射agomir-493上调miR-493的表达,应用FITC灌注检测梗塞周边血管灌注;原代培养大鼠脑微血管内皮细胞(RBMECs),建立糖氧剥夺(OGD)模型模拟缺血状态,利用PCR检测miR-493的表达;miR-493 mimic和miR-493 inhibitor转染RBMECs以上下调细胞中miR-493的表达,利用基质胶实验检测miR-493对RBMECs管腔形成的影响,transwell实验和细胞划痕实验检测miR-493对RBMECs迁移能力的影响,CCK8检测miR-493对RBMECs增殖能力的影响。分别利用PCR、western-blot检测大鼠MCAO模型梗塞周边区巨噬细胞游走抑制因子(MIF)mRNA和蛋白水平的表达;利用PCR、western-blot、 ELISA检测OGD6小时的RBMECs中MIFmRNA及蛋白水平的表达。应用miR-493mmimic和miR-493 inhibitor上下调miR-493后,PCR、Western-blot和ELISA检测RBMECs中MIF mRNA及蛋白水平的表达。双荧光素酶实验检测MIF是否为miR-493的直接靶点。在RBMECs中,利用siRNA技术干扰miR-493与MIF结合,再外源性给予重组MIF并转染miR-493 inhibitor,观察miR-493对RBMECs管腔形成、迁移及增殖的影响是否依赖MIF。分别应用miR-493mimic和miR-493 inhibitor上下调miR-493的表达,western-blot检测AKT、p-AKT、ERK、p-ERK的表达。建立大鼠MCAO模型后,侧脑室注射antagomir-493下调miR-493的表达,应用TTC检测梗塞面积,改良神经功能评分评估神经功能,FITC检测梗塞周边血管灌注情况。结果:1)大鼠MCAO后第3天及第7天miR-493的表达下降,OGD6小时后RBMECs中miR-493表达亦下降。2)建立MCAO模型后,侧脑室注射agomir-493,大鼠梗塞周边血管灌注减少。3)转染miR-493 mimic后,RBMECs的管腔形成、增殖及迁移均减少,而转染miR-493 inhibitor则相反。4)通过筛查数据库找到miR-493可能的作用靶点MIF,证实缺血缺氧后MIF表达上调,并受miR-493负向调控,双荧光素酶实验进一步证实MIF为miR-493的直接作用靶点。5)通过siRNA干扰miR-493与MIF作用位点,转染miR-493 inhibitor后,RBMECs的管腔形成、细胞增殖及迁移能力受到抑制,而给予外源性MIF后可使其部分恢复,进一步证实miR-493对血管新生的影响依赖于MIF。 6)p-AKT、p-ERK表达受miR-493负向调控,并受MIF调控,证实MIF下游为AKT、ERK通路。7)大鼠MCAO后侧脑室注射antagomir-493下调miR-493的表达,发现梗塞面积减小,神经功能评分增高,梗塞周边血流灌注增多。结论:脑梗塞后miR-493表达下降。miR-493可调控脑梗塞后血管新生,其作用依赖于其直接作用靶点MIF。MIFF游为AKT、ERK通路。脑梗塞后可通过下调miR-493促进梗塞周边血管新生,提高神经功能修复。miR-493可作为脑梗塞后治疗的新靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R743.3;R-332
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