杀伤性人工抗原提呈细胞靶向杀伤抗原特异性T细胞及抑制皮肤移植排斥的研究

发布时间：2017-12-31 19:13

本文关键词：杀伤性人工抗原提呈细胞靶向杀伤抗原特异性T细胞及抑制皮肤移植排斥的研究　出处：《东南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：系统性使用大剂量免疫抑制药物治疗移植排斥导致的众多副作用,促使了针对移植排斥的特异性免疫疗法的发展。选择性清除或抑制同种反应性T细胞是治疗移植排斥的理想策略之一。因此,近十余年来,非细胞性的、以抗原肽/主要组织相容性抗原(peptide/major histocompatibility complex, p/MHC)为靶向的,针对抗原特异性T细胞的特异性杀伤制剂被广泛研究。最新的进展之一是在非细胞性载体表面包被pMHC多聚体和Fas配体,制备杀伤性人工抗原递呈细胞(Killer artificial antigen-presenting cells, KaAPCs)。其中以磁珠或胶乳微球为载体的KaAPCs已经被报道能在体外选择性杀伤抗原特异性T细胞。然而,此类载体不易在体内生物降解,缺乏生物相容性,且在体内和器官移植模型中的研究鲜有报道。本研究是以可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)微球(Microparticles, MPs)作为载体,在其表面共包被H-2Kb-Ig二聚体和anti-Fas单抗,制备成基于PLGA的KaAPCs。其表面的H-2Kb-Ig二聚体可以装载特定的抗原肽,形成p/MHC复合体,从而与抗原特异性T细胞的TCR靶向结合,同时其表面的anti-Fas单抗能够诱导抗原特异性T细胞凋亡,达到靶向杀伤抗原特异性T细胞的目的。在同种异体移植模型中,KaAPCs表面的H-2Kb-Ig二聚体即作为同种抗原,与受者鼠体内H-2Kb同种抗原反应性CD8+T细胞的TCR特异性结合,并利用anti-Fas单抗诱导活化的同种反应性T细胞凋亡,实现对移植排斥的特异性免疫治疗。研究目的：以OT-1转基因小鼠为模型研究KaAPCs能否在体外和其体内选择性清除OVA257-264抗原特异性T细胞；并以小鼠同利,异体皮肤移植为模型,分析KaAPCs特异性杀伤同种反应性T细胞的能力和治疗移植排斥的效果,进而探讨其在体内的作用机制。研究方法及结果：1、PLGA MPs的制备及表征：以PLGA聚合物为原材料,采用乳化溶剂挥发法制备直径约为5μm的PLGA MPs,并利用化学修饰法使其表面功能化(带有NH2+)；通过扫描电镜(Scanning Electronic Microscopy,SEM)、粒径分析仪和Zeta电位分析仪对PLGA MPs进行表征,并通过蛋白定量和流式技术分析其吸附蛋白的能力。结果显示：PLGA MPs在SEM下呈现良好的球形,粒径分布在1-10gmn,且80%的MPs集中在5-6μm,平均Zeta电位为65.2±6.7 mV,表明其带有足够电荷,2×107MPs对BSA的最大吸附量为80μg。以上结果表明自制的PLGA MPs具有良好的表征。2、KaAPCs的制备及其表型分析：把PLGA MPs和H-2Kb-Ig二聚体以及anti-Fas单抗共孵育后,制备成KaAPCs,并经特异性荧光单抗染色、流式细胞技术和激光共聚焦技术验证KaAPCs表型。结果显示,H-2Kb-Ig二聚体和anti-Fas单抗被成功共包被到PLGA MPs表面,表明所制的KaAPCs具有良好的表型。3、KaAPCs靶向杀伤OVA257-264抗原特异性T细胞：在体外,把装载OVA257-264的KaAPCs (Kb/OVA-KaAPC)与OT-1转基因小鼠(其CD8+T细胞TCR以H-2Kb限制的方式识别OVA257-264)的脾细胞共孵育24小时,通过流式细胞术检测T细胞群中CD8+T细胞的凋亡比例以及OVA257-264特异性CD8+T细胞的数量比例。结果显示Kb/OVA-KaAPC能够诱导大约80%的CD8+T细胞凋亡,OVA257-264特异性CD8+T细胞比例显著下降83%左右。而无关抗原肽对照组没有出现明显凋亡,OVA257-264特异性CD8+T细胞没有明显减少,表明KaAPCs能够在体外特异性地杀伤抗原特异性CD8+T细胞。其中anti-Fas介导的凋亡为主,活化诱导的凋亡(AICD)极少。在体内,Kb/OVA-KaAPC经尾静脉注入OT-1鼠后,在不同时间点通过流式细胞术分析其外周血中CD8+T细胞的凋亡比例及OVA257-264特异性CD8+T细胞的数量比例。结果与体外实验相似,CD8+T细胞凋亡比例最高达75%左右,OVA257-264特异性CD8+T细胞的比例最高下降大约84%,而对照组无显著变化。KaAPC的杀伤效率与其剂量、作用时间呈正相关。这表明KaAPC在体内也能靶向杀伤抗原特异性的CD8+T细胞。4、KaAPC抑制小鼠皮肤移植排斥的有效方案的研究：以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)为供受体,建立同种异体皮肤移植模型。KaAPCs(包被自制H-2Kb单体和商品化anti-Fas单抗)经尾静脉或局部注入受者鼠后,观察移植皮块的生存状况,进行临床评分,并通过免疫荧光染色检测移植皮块中CD8+T和CD4+T细胞的浸润量,同时多指标监测受者鼠的整体免疫功能。结果：比较多种方案的效果后,明确了靶向抗原和anti-Fas的包被剂量、KaAPCs的注射途径、剂量、次数和时间点等治疗措施。据此,KaAPCs能显著延长移植皮块的生存时间达4-6天,并明显减少移植皮块中CD8+T细胞的浸润数量,对CD4+T细胞无明显影响,且不明显抑制受者鼠的整体免疫功能。5、KaAPC抑制小鼠皮肤移植排斥的优化方案及其机制研究：以C57BL/6鼠(H-2Kb)和bml鼠(H-2Kbml)为供受体,建立同种异体皮肤移植模型。在优化方案下,经三次尾静脉注射KaAPCs(包被商品化H-2Kb-Ig二聚体和商品化anti-Fas)治疗受者鼠后,观察移植皮块的生存状况和排斥程度；流式细胞术检测受者鼠外周血和脾脏中T细胞的凋亡比例及H-2Kb同种反应性CD8+T细胞比例；免疫组化分析移植皮块中浸润的CD8+ T、CD4+T细胞和H-2Kb同种反应性T细胞的量；针对供体的同种增殖能力检测；脾脏及淋巴结中调节性T细胞的检测；KaAPCs对受者鼠脾脏中B、NK、 T细胞以及外周血中单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞群等的影响；通过抗肿瘤能力、T细胞库针对第三方抗原的同种增殖能力和NK细胞杀瘤能力的分析,监测KaAPCs对受者鼠整体免疫功能的影响；观察KaAPCs在体内的运行和分布。结果显示：三次尾静脉输注后KaAPCs能经血流进入淋巴结和脾脏,并与CD8+T细胞直接接触,有效地靶向杀伤外周血和脾脏中同种反应性CD8+T细胞,杀伤率达82%左右,从而大幅减少了同种反应性CD8+T细胞在移植皮块中的浸润,同时上调了淋巴结中调节性T细胞的水平,最终延长移植皮块的存活时间达42.5天,且对受者鼠体内的其他免疫细胞群没有明显影响,也没有显著损伤受者鼠的整体免疫功能。结论：基于PLGA微球的KaAPCs能够在体外和体内选择性杀伤抗原特异性CD8+T细胞,且能在不损伤受者鼠整体免疫功能的情况下,通过靶向杀伤同种反应性CD8+T细胞而有效抑制同种皮肤移植排斥反应,显著延长皮肤移植物的存活期。提示KaAPCs可以作为治疗移植排斥或自身免疫病的新型特异性免疫治疗策略。
[Abstract]:Systematic use of large dose immunosuppressive drugs for the treatment of many side effects caused by graft rejection has contributed to the development of specific immunotherapy for transplant rejection . The selective removal or inhibition of alloreactive T cells is one of the ideal strategies for the treatment of transplant rejection . One of the most recent developments is the inclusion of pMHC multimers and Fas ligands on the surface of non - cellular carriers to prepare killer artificial antigen - presenting cells , Kaolinones . In vivo and in vivo , the H - 2Kb - Ig dimer ( PLGA ) microspheres were used as a carrier to study the specific cytotoxic T - cells in vitro and in vivo . The percentage of CD8 + T cells in peripheral blood and the percentage of OVA257 - 264 specific CD8 + T cells were investigated by flow cytometry . The percentage of T cells in peripheral blood and spleen of recipient mice and the ratio of H - 2Kb alloreactive CD8 + T cells were detected by flow cytometry . The effects of activated CD8 + T , CD4 + T cells and H - 2Kb alloreactive T cells were detected by immunohistochemistry .

【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392.4

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