问号钩端螺旋体HD-GYP结构域蛋白的酶学活性和功能分析

发布时间：2018-01-03 09:05

  本文关键词：问号钩端螺旋体HD-GYP结构域蛋白的酶学活性和功能分析　出处：《浙江大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的 问号钩端螺旋体(简称钩体)是引起钩体病的重要病原体,人类通过被带菌动物尿液污染的疫水或疫土而感染,趋化和运动系统在钩体感染过程中发挥重要作用。钩体基因组序列分析证明其中有数个趋化调节蛋白CheB和CheR的编码基因,但其具体的调控机制未知。方法1、Real-timePCR检测了钩体基因组中5个基因在钩体感染宿主细胞过程中mRNA的水平变化;2、T-A克隆了 CheB和CheR的编码基因片段并构建了原核表达系统;3、检测了 c-di-GMP浓度变化对CheB和CheR表达菌株表型的影响。结果1、在感染细胞60min后,cheB1的mRNA水平显著提高,cheB3也有一定程度的提高,而cheB2和cheR则无明显差异;2、成功构建了 5个基因的原核表达系统,其中重组CheB1、CheB3和CheR2蛋白使大肠杆菌运动能力明显增强;3、在加入鸟苷酸环化酶抑制剂和磷酸二酯酶抑制剂后,各表达菌株形成菌落大小与对照相比无明显不同,但CheB2菌落形态与对照相比出现明显褶皱。结论CheB和CheR可影响大肠杆菌的swarming运动能力,并受胞内c-di-GMP浓度的影响。目的钩体病是由致病性钩端螺旋体引起的全球流行的人畜共患病,每年有超过50万的病例报告。环二鸟苷信号系统是广泛存在于细菌体内的新型二元信号系统,可以感知外界环境信号并调控细菌运动性、毒力和生物膜形成等多种生理功能。环二鸟苷酸信号分子在胞内的代谢由含有GGDEF结构域的二鸟苷环化酶(diguanylate cyclase,DGC)和含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二醋酶(phosphodiesterase,PDE)调控。生物信息学分析发现了钩体两个HD-GYP结构域磷酸二酯酶的编码基因LA2383和LA2847,但其具体功能未知。方法 1、通过Real-time PCR检测了钩体基因组中LA2383和LA2847两个基因在钩体感染宿主细胞过程中mRNA水平的变化;2、采用T-A克隆等分子生物学方法构建了L42383和LA2847基因的原核表达系统;3、运用酶标仪及液相色谱仪检测了纯化的重组蛋白对特异性底物bis-pNPP、c-di-GMP、c-di-AMP、cGMP、cAMP及pGpG的磷酸二酯酶活性;4、构建报告质粒检测目的蛋白在大肠杆菌胞内的磷酸二酯酶活性。结果1、在感染宿主细胞12h时,LA2383基因的mRNA水平明显提高,LA2847基因的mRNA水平也有一定程度的提高;2、成功构建了LA2383和LA2847基因的原核表达系统,通过表达、纯化或复性得到单一的目的蛋白;3、LA2383蛋白可以分解特异性底物bis-pNPP,对底物pGpG的酶活性要高于c-di-GMP,而LA2847蛋白对实验所用底物均无法分解;4、LA2383和LA2847基因在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达后,细菌胞内c-di-GMP水平下降。结论LA2383和LA2847基因的mRNA水平在钩体感染细胞的过程中具有先降后升的趋势,在感染后12h达到峰值;HD-GYP结构域蛋白LA2383具有磷酸二酯酶活性,可以降解c-di-GMP和pGpG;过表达LA2383和LA2847蛋白使大肠杆菌胞内c-di-GMP水平下降;因此,推测HD-GYP结构域蛋白在钩体感染过程中发挥重要作用。
[Abstract]:The purpose of Leptospira interrogans (leptopira) is an important pathogen of causing human leptospirosis. By infected animal urine pollution water and soil disease or infection, chemotaxis and motility system play an important role in the process of Leptospira infection. Leptospira genome sequence analysis proved that the number of chemotaxis genes encoding regulatory proteins CheB and CheR, but the specific regulatory mechanism is unknown. Methods 1, Real-timePCR detected mRNA levels of 5 genes in the genome of Leptospira in Leptospira infection of host cells in the process; 2, T-A gene encoding fragment of CheB and CheR and construct a prokaryotic expression system; 3, the detection of c-di-GMP concentration effect the phenotypes of strains on CheB and CheR. The results of 1 in infected cells after 60min cheB1, the mRNA level increased significantly, cheB3 also has a certain degree of improvement, but there was no obvious difference between cheB2 and cheR; 2, was constructed successfully. The prokaryotic expression system of 5 genes, including CheB3 recombinant CheB1 and CheR2 protein of Escherichia coli movement ability significantly enhanced; 3, adding inhibitor of guanylate cyclase and phosphodiesterase inhibitor, the expression of strain formed colony size compared with the control without significantly different, but the colony of CheB2 compared with the control group significantly fold. Conclusion CheB and CheR can affect the swarming movement ability of Escherichia coli, and affected the intracellular c-di-GMP concentration. The purpose of leptospirosis is caused by pathogenic Leptospira global epidemic zoonosis, a case report of over 500 thousand each year. The cyclic Diguanylic signal system is widely existed in bacteria in vivo the new $two signal system, can sense the external environment signals and regulation of bacterial motility, virulence and biofilm formation and various physiological functions. Xie You cyclic Diguanylate in intracellular signal molecules Diguanylic ring domain containing GGDEF enzyme (Diguanylate cyclase, DGC) and EAL or HD-GYP domain containing two phosphoric acid vinegar (phosphodiesterase, PDE) enzyme regulation. Bioinformatics analysis showed that the hook two HD-GYP domain phosphodiesterase genes encoding LA2383 and LA2847, but its function is unknown. 1. By Real-time PCR to detect the changes of LA2383 and LA2847 of Leptospira genome two mRNA gene in Leptospira infection of host cells in the process; 2, we constructed a prokaryotic expression system of L42383 and LA2847 genes were cloned by T-A and other molecular biological methods; 3, using microplate and liquid chromatography. The purified recombinant protein of the specific substrate of bis-pNPP, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP and pGpG 4, phosphate phosphodiesterase activity; construct protein detection report plasmid in Escherichia coli two intracellular esterase activity. Results in 1. The infection of host cells 12h, LA2383 gene mRNA was significantly improved, the LA2847 gene mRNA level has been improved to a certain degree; 2, construct a prokaryotic expression system, LA2383 and LA2847 gene expression through purification, renaturation or single target protein; 3, LA2383 protein can decompose the specific substrate of bis-pNPP the enzyme activity on substrate, pGpG was higher than that of c-di-GMP and LA2847 protein on the substrate are not decomposition; 4, LA2383 and LA2847 gene in Escherichia coli BL21 (DE3) over expression, c-di-GMP level in bacteria cell decreased. Conclusion LA2383 and LA2847 gene mRNA level is decreased first and then increased trend in the process of Leptospira infected cells, and reached the peak at 12h after infection; HD-GYP domain protein LA2383 with phosphodiesterase activity, can degrade c-di-GMP and pGpG; overexpression of LA2383 and LA2847 protein in Escherichia coli intracellular water c-di-GMP Therefore, we speculated that HD-GYP fell flat; domain proteins play an important role in the process of Leptospira infection.

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R377.5

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本文编号：1373270