小鼠子宫内膜mRNAs和miRNAs时空表达与胚胎着床的关系及SPOP对基质细胞蜕膜化的影响

发布时间：2018-01-03 13:02

  本文关键词：小鼠子宫内膜mRNAs和miRNAs时空表达与胚胎着床的关系及SPOP对基质细胞蜕膜化的影响　出处：《重庆医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一部分小鼠子宫内膜mRNAs和miRNAs的时空表达与胚胎着床的相关性研究目的：胚胎围着床是一个动态的生理过程,这一过程被分成三个阶段,分别是容受前期、容受期和胚胎着床期。整个胚胎围着床过程子宫内膜形态和分子发生显著改变。子宫内膜在不同时间,不同部位基因差异表达是引起细胞组织形态和分子变化的原因,同时这也确保了胚胎成功的着床。microRNA(miRNA)是重要的调节分子,miRNA主要在细胞、组织的增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥作用。而在胚胎着床过程中miRNA同样发挥重要的调节作用,miRNAs的对基因的调节作用决定了基因差异表达的形成。动态分析胚胎着床过程中mRNA谱和microRNA谱的变化特征,可以为全面理解和阐释胚胎动态着床过程中的机制提供坚实的实验支持。方法：分别收集容受前期、容受期和胚胎着床期子宫内膜组织,对应于小鼠孕第一天(d1)、孕第四天(d4)和孕第五天着床点(d5IS)和孕第五天着床旁(d5IIS)的昆明小鼠子宫内膜组织。采用Trizol法提取样本总RNA。采用深度测序技术检测小鼠子宫内膜不同时期(d1、d4和d5)或不同部位(d5IS和d5IIS)的mRNA和microRNA的表达情况。采用RT-PCR检测随机选择的miRNA和mR NA表达水平是否与NGS检测的结果一致。通过NGS测序获得小鼠孕d1、d4、d5IS和d5IIS的mRNA表达谱,并将四组数据进行两两成对比较,筛选出显著性差异表达基因,采用维恩图对小鼠围着床期基因表达进行动态分析。通过NGS测序获得小鼠d1、d4、d5IS和d5IIS的miRNA表达谱,通过两两成对比较获得显著性差异的miRNAs,再利用Targetscan database、 miRanda database和DIANA-microT 3.0三种软件预测miRNA的靶向基因,最后预测结果采取交集定为最终的靶基因。利用mRNA谱确定靶基因的表达量,同时结合miRNA表达量筛选出miRNA与对应靶向基因是否具有负向调节的关系。结果：NGS检测的miRNAs结果表明d 1、d4、d5IS和d5IIS的miRNAs表达具有显著差异,其中d1和d5IS组织中以上调miRNAs表达为主；而d4组织中以下调的miRNAs表达为主。提示在围着床期miRNAs具有不同的作用。对显著差异表达的63个miRNAs进行靶基因预测,获得5720个靶基因。结合miRNAs谱和mRNAs谱的表达水平,在d1、d4、d5三个时间点共筛选出1473对miRNA-mRNA呈现负相关性表达,而在d1、d4、d5三个时间点miRNA-mRNA表达量都始终保持负相关的有138对。在负相关表达的miRNA-mRNA对中随机选取5对miRNA-mRNAs利用实时荧光定量PCR进行检测miRNA-mRNAs各自的表达量,验证了NGS检测的miRNA和mRNA数据谱可靠性,同时证明了在围着床期miRNA-mRNA存在负相关性,表明miRNA对mRNA具有调控作用。根据miRNA-mRNA相互作用网络图分析,表明了miRNAs对mRNAs的调节作用。同时揭示了与容受态功能相关的Bcl-2,Klf13和PGR基因是网络图中核心miRNA:mmu-miR-106a-5p,mmu-miR-200b-3p,mmu-miR-96-5p的靶基因。结论：NGS检测的mRNAs结果表明孕d1、d4、d5IS和d5IIS的mRNA表达具有显著时空差异性,这种表达差异决定了围着床期子宫内膜在不同时期和部位发挥不同作用。在胚胎着床时miRNAs对mRNAs表达存在调控作用。而这种调节方式在围着床期的整个过程持续发挥作用。多个与与容受态相关的Bcl-2,Klf13和PGR基因是核心miRNA的靶基因表明miRNAs在小鼠子宫内膜容受状态的形成和维持早期妊娠中发挥重要作用。第二部分SPOP对子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响目的：子宫内膜基质细胞蜕膜分化是成功实现胚胎着床的重要过程,受雌孕激素调节的子宫内膜基质细胞在这一过程发生明显的增殖、分化。我们前期研究证明,SPOP在胚胎着床第5天的着床点和着床旁组织中表达存在显著差异,而SPOP与泛素化作用密切相关。关于泛素化与胚胎着床的相关研究尚未见报道。因此,本课题着眼于小鼠围着床期SPOP研究,揭示SPOP在胚胎着床过程中发挥的作用。方法：建立昆明小鼠早孕模型、小鼠假孕模型、人工激素调控的小鼠模型。采用定量PT-PCR、Western blot和免疫组织化学技术检测SPOP mRNA或蛋白在各种模型小鼠(早孕小鼠,假孕小鼠和激素调控)子宫内膜中表达规律。采用siRNA构建人工诱导蜕膜细胞SPOP敲除模型。siRNA敲除SPOP后,检测蜕膜化细胞蜕膜标志物的表达情况。利用流式细胞技术检测SPOP对凋亡作用的影响。结果：SPOP在围着床期呈波动表达dl、d2和d3表达较低,从d4到d6表达显著增加,d7表达出现回落。假孕小鼠模型中SPOP具有同样波动表达的模式。人工诱导蜕膜化后小鼠子宫内膜SPOP表达显著增加。利用激素调控小鼠模型证实SPOP的表达受雌激素和孕激素的调控。siRNA敲除SPOP后基质蜕膜细胞的蜕膜标志物(IGFBP-1和C yclinD3)表达水平显著降低。SPOP能够抑制基质细胞凋亡发生结论：雌激素、孕激素能够调节SPOP的表达,SPOP通过抑制凋亡、泛素化作用影响基质细胞蜕膜化发生,能促进基质细胞蜕膜分化。
[Abstract]:The first part of the study of space-time expression of mRNAs and miRNAs between mouse endometrium and embryo implantation Objective: embryo implantation is physiological around a dynamic process, this process is divided into three stages, namely early stage and suffer, suffer during embryo implantation. The whole embryo around the bed of endometrial morphology and molecular change. The endometrium at different time and different position of gene expression is the cause of the morphological and molecular changes of cells and tissues, it also ensures the successful embryo implantation of.MicroRNA (miRNA) is an important regulatory molecule, mainly in miRNA cells, proliferation, differentiation, apoptosis and other physiological processes play a role in embryo. In the process of implantation miRNA also play an important role in the regulation of miRNAs gene, to determine the form of differential gene expression. Dynamic analysis of embryo implantation process mR NA spectrum and microRNA spectrum characteristics, can provide solid support for the comprehensive understanding and interpretation of the dynamic mechanism in the process of embryo implantation. Methods: during the early stage and tissue in endometrium during embryo implantation, corresponding to the first day of pregnant mice (D1), day fourth of gestation (D4) and at Fifth implantation sites (d5IS) and at day fifth (d5IIS) of Kunming by implantation of mouse endometrial tissue. The sample was extracted by Trizol total RNA. using deep sequencing technology to detect mouse endometrium in different periods (D1, D4 and D5) or different parts (d5IS and d5IIS) expression of mRNA and microRNA by RT-PCR. To detect the expression of miRNA and mR NA were randomly selected and NGS level detection results. Get pregnant D1 mice by NGS sequencing, D4, d5IS and d5IIS mRNA expression, and the data of the four groups were screened out 22 pairwise comparison, significant difference table As the gene, a Venn diagram for dynamic analysis of periimplantation. Gene expression of mouse D1 by NGS sequencing, D4, d5IS and d5IIS miRNA expression by 22, obtained significant difference pairwise comparison of miRNAs, then Targetscan database, miRanda database and DIANA-microT 3 three miRNA target gene prediction software finally, the prediction results taken as the final intersection of target gene. Target gene expression spectrum determined by mRNA, combined with the expression of miRNA miRNA was screened with the corresponding target gene has negative regulation relationship. Results: the detection of NGS miRNAs results showed that D 1, D4, d5IS and d5IIS miRNAs expression significant differences among D1 and d5IS tissues above miRNAs expression; D4 and tissue miRNAs expression. The following tips have different effects during the peri implantation period miRNAs. Significant differences on table 63 miRNAs as the target gene prediction, 5720 target genes. Combined with the expression of miRNAs and mRNAs spectra in D1, D4, D5 three time points were selected from 1473 of miRNA-mRNA showed a negative correlation expression, while in the D1, D4, D5 expression in three time points of miRNA-mRNA were maintained the negative correlation of 138. In the negative expression of miRNA-mRNA on 5 randomly selected for miRNA-mRNAs using real-time fluorescence quantitative PCR to detect the expression of miRNA-mRNAs of each volume, verify the detection of NGS miRNA and mRNA spectral data reliability, and that during the peri implantation period there is a negative correlation between the miRNA-mRNA, show that miRNA has a role in the regulation of mRNA according to the analysis of miRNA-mRNA interaction network, shows that the effect of miRNAs on the mRNAs. At the same time reveals the related and receptivity state function of Bcl-2, Klf13 and PGR genes in the network diagram of core miRNA: mmu-miR-106a-5p, mmu-miR- 200b-3p, the target gene of mmu-miR-96-5p. Conclusion: NGS mRNAs results showed that D4, d5IS. D1, d5IIS and mRNA expression have significant temporal differences, the expression difference of periimplantation endometrium play different roles in different stages and parts. The expression of miRNAs in embryo implantation has regulatory effect on mRNAs. This adjustment in the periimplantation period the whole process continued to play a role. Multiple and receptivity state related Bcl-2, Klf13 and PGR gene is the target gene core miRNA show that miRNAs in mice endometrial receptivity in the formation and maintenance of early pregnancy play an important role. The second part SPOP of endometrial stromal cell decidualization Objective: endometrial stromal cells in decidual differentiation is the successful implementation of an important process of embryo implantation, the occurrence in the process of estrogen and progesterone regulation of endometrial stromal cells. Obvious proliferation and differentiation. Our previous studies have proved that there are significant differences in the expression of SPOP in embryo implantation fifth days of implantation site and adjacent tissues, while SPOP and ubiquitination are closely related. Related research about the ubiquitination and embryo implantation has not been reported. Therefore, this study focused on mice of SPOP bed around the stage reveal, SPOP play in embryo implantation process. Methods: Kunming mice model of early pregnancy, pseudopregnancy mice model, mice model of artificial hormone regulation. By quantitative PT-PCR, Western blot and immunohistochemical detection of SPOP or mRNA proteins in various model mice (mouse, pseudopregnant mice and hormonal regulation of endometrial expression) in order to construct knockout model..siRNA knockdown of SPOP after artificial induction of SPOP in decidual cells by siRNA, detection of decidualization marker decidual cells expression by flow cytometry. Effect of detection of SPOP on apoptosis. Results: SPOP during the peri implantation period fluctuated expression of DL, D2 and D3 had low expression, from D4 to D6 was significantly increased, the expression of D7 declined. SPOP pseudopregnant mice model with the same expression pattern. Fluctuations induced by small pieces of endometrial SPOP expression increased significantly in decidua after using the mouse model confirmed the hormone regulation. The regulation of.SiRNA SPOP expression by estrogen and progesterone knockout SPOP stromal decidual cell decidual markers (IGFBP-1 and C yclinD3) expression level was significantly lower in.SPOP can inhibit the apoptosis of stromal cells. Conclusion: estrogen, progesterone can regulate the expression of SPOP and SPOP by inhibiting apoptosis, ubiquitin the occurrence of stromal cell decidualization of stromal cells can promote decidual differentiation.

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R321.3

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