基于RNA-Seq技术发现福氏志贺菌新sRNA及探讨其致病机制研究

发布时间：2018-01-03 17:15

本文关键词：基于RNA-Seq技术发现福氏志贺菌新sRNA及探讨其致病机制研究　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目前研究表明,sRNA(small regulatory RNAs)在细菌生命的各个环节均发挥着重要调控作用,细菌10%-30%的基因受sRNA调控,如sRNA参与了细菌环境耐受、质粒复制和细菌入侵等重要功能调节。为此,本文以志贺菌为研究对象,运用RNA-seq技术开展了新sRNA发现研究,并探讨其可能的致病机制。志贺菌每年导致全球约1.6亿人感染,绝大多数在发展国家,并导致110万死亡,我国的志贺菌感染也非常严重,在我国乙类传染病发病率中志贺菌位于第4位,病死率位居第3位,且在我国以福氏志贺菌流行为主。然而,与大肠杆菌中已发现100余条sRNA相比,福氏志贺菌仅有2条sRNA被功能注释,因此,系统开展福氏志贺菌的sRNA识别和功能研究,阐明sRNA在福氏志贺菌致病过程中的重要生物学功能和具体的作用机制,将为进一步抗志贺菌感染提供更为深入的理论基础和可能的药物新靶标,对阐明细菌的致病机制和抗细菌感染研究具有重要意义。RNA-seq技术不仅可以检测基因序列,还可以检测它们的表达水平,同时可以识别大量未知转录本,且具有检测准确率高、重复性好和高通量等特点,被广泛用于细菌sRNA发现。另外,目前研究发现,细菌sRNA分子伴侣蛋白HFQ通过与sRNA结合调控细菌的环境耐受力和毒力等功能。因此,本研究基于RNA-Seq技术,在福氏志贺菌首次开展hfq基因缺失株和野生株转录谱研究,发现hfq基因在福氏志贺菌中的功能和调控机制。并结合生物信息学预测与实验验证,在福氏志贺菌中系统发现了与HFQ蛋白结合的新sRNA基因,同时,结合sRNA靶标预测,开展新发现sRNA可能致病机制研究,本文主要包括如下5个部分:第一部分:利用λ-RED同源重组方法成功构建了福氏志贺菌hfq基因突变株,并对福氏志贺菌开展hfq基因缺失株和野生株转录谱测序,获得了福氏志贺菌野生株301与hfq基因缺失株高质量的转录谱序列,为阐明hfq基因在福氏志贺菌中的功能,以及福氏志贺新sRNA的发现及其可能调控网络的构建提供了数据基础。第二部分:系统分析了野生株301和hfq基因缺失株的高通量测序数据,初步发现了hfq基因的调控功能,分析结果显示,HFQ调控了福氏志贺菌基因组约16.05%的基因,且大多数与毒力相关的基因在hfq基因缺失株中显著低表达,定量PCR结果与测序结果一致,说明HFQ直接或间接的调控这些毒力因子。同时,T3SS是志贺菌侵入宿主细胞所必不可少的,然而在hfq基因缺失株中,T3SS相关的基因及其调控基因均显著下调或者不表达,表明HFQ蛋白参与了T3SS系统的调控。而部分耐酸基因在缺失株也出现了显著下调,说明HFQ蛋白也参与了耐酸调节。第三部分:通过对转录谱数据的深入分析,发现了大量位于基因间区的新转录本,共获得了717条新sRNA,而野生株301和hfq基因缺失株之间具有显著差异的sRNA有280条,这些sRNA可能与HFQ结合来发挥调控作用。为了提高发现新sRNA的准确性,我们还对新发现sRNA开展启动子和终止子预测,发现共有243条sRNA具有完整转录单元,我们取长度大于80bp的92条sRNA用作下一步的实验验证。第四部分:利用反转录PCR方法,对92条sRNA在不同的生长阶段(6小时、9小时和12小时)分别进行检测,结果表明,92条sRNA在不同的时间点全部被检测到。同时,我们也对这92条sRNA开展Nothern杂交检测,最终发现10 sRNA有杂交信号,新发现的10条sRNA分别命名为:sf29、sf46、sf47、sf63、sf69、sf80、sf83、sf86、sf87、sf90。第五部分:我们对新发现的10条sRNA开展系统的靶标预测,发现其可能的作用机制和通路,发现sRNA sf46、sf69、sf80可能参与了毒力调控,其主要的靶标是T3SS基因;sRNA sf83参与了适应环境压力调控,其调控通路主要是通过sf83 sRNA与HFQ结合来调节evg S表达,而evg S表达水平的改变导致耐受环境蛋白evg A的变化,进而影响志贺菌的耐受性;sRNA sf63、sf83、sf87、sf90同时参与了毒力和环境耐受调控,主要是通过调控T3SS来发挥致病调节,而通过调节hde B和hde B等耐酸蛋白来进行环境耐受调控。第一部分构建的福氏志贺菌hfq基因突变株,为第二部分获得野生株和hfq基因缺失株的高通量测序数据奠定基础,而高通量数据的获得为第三部分研究hfq基因功能及发现新sRNA提供数据支持,第四部分则为预测的sRNA候选基因开展系统实验验证,第五部分则是对新发现的sRNA开展靶标预测,发现其可能的作用机制和通路。综上所述,我们基于RNA-seq技术,首次开展了福氏志贺菌hfq基因缺失株和野生株转录谱研究,发现了HFQ蛋白在福氏志贺菌中的功能和调控机制,并在福氏志贺菌中系统发现了10新sRNA及其可能作用通路。该研究为抗志贺菌感染提供了更为深入的理论基础和可能的药物新靶标。
[Abstract]:In this paper , we have found that the expression of sRNA can be regulated by the RNA - seq technique . In order to improve the accuracy of the new sRNA , we found that there were a number of new transcripts in the gene region . Based on RNA - seq technology , we studied the function and regulation mechanism of hde B and hde B , and found 10 new sRNA and its possible pathways . In conclusion , we provide a deeper theoretical basis and possible new target for anti - Shigella infection .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378

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