嘌呤受体P2X7和P2Y2在大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中的作用

发布时间：2018-01-10 08:34

  本文关键词：嘌呤受体P2X7和P2Y2在大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中的作用　出处：《华中科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 嘌呤受体 骨髓间充质干细胞 成骨分化 成脂分化

【摘要】：目的探讨嘌呤受体P2X7和P2Y2在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨和成脂分化中的作用。方法1.体外实验(1)受体表达检测：免疫荧光染色检测BMSCs上嘌呤受体P2X7和P2Y2的表达,RT-qPCR及Western-blot检测受体表达与细胞分化状态的关系；(2)细胞增殖及活性检测：CCK-8试剂盒检测激活嘌呤受体P2X7和P2Y2对BMSCs增殖及细胞活性的影响；(3)成骨分化检测：RT-qPCR及Western-blot检测成骨指标(RUNX2,ALP及OPN)的表达；茜素红染色检测钙结节形成；ALP(碱性磷酸酶)染色检测ALP生成：(4)成脂分化检测：RT-qPCR及Western-blot检测成脂指标(PPARy,FABP4及Adipsin)的表达；油红O染色检测脂滴生成；(5)基因沉默技术：siRNA分别沉默P2X7和P2Y2受体,检测嘌呤受体P2X7和P2Y2在BMSCs成骨和成脂分化中的作用；(6)信号通路检测：Western-blot检测激活嘌呤受体P2X7和P2Y2后其下游被激活的信号通路。2.体内实验(1)动物模型：用小鼠卵巢切除骨质疏松模型研究在体内激活嘌呤受体P2X7后对松质骨、皮质骨及髓腔内脂肪生成的影响；(2)组织形态学分析：microCT检测松质骨和皮质骨骨参数；HE染色检测松质骨骨参数和髓腔内脂滴形成。结果1.SD大鼠BMSCs上表达嘌呤受体P2X7和P2Y2;在成骨分化过程中P2Y2受体表达逐渐减少,而P2X7受体表达逐渐增加；在成脂分化过程中P2Y2受体表达逐渐增多,而P2X7受体表达逐渐减少。2. BzATP通过激活P2X7受体促进BMSCs成骨指标表达、ALP生成及钙结节形成,抑制成脂指标表达及脂滴的形成。P2X7受体的siRNA和特异性拮抗剂(BBG)完全阻止了BzATP的作用。microCT显示BzATP可以减少因卵巢切除所致的松质骨丢失,但对皮质骨的参数没有影响；HE染色显示BzATP可以增加卵巢切除小鼠的松质骨数目和体积,使骨髓腔内脂滴生成减少。3. BzATP刺激使ERK1/2和JNK磷酸化增加,BBG抑制BzATP诱导的ERK1/2和JNK的磷酸化；阻滞ERK1/2和JNK信号通路后,BzATP对BMSCs成骨和成脂基因表达的影响消失。4.UTP(三磷酸尿苷)通过激活P2Y2受体抑制BMSCs成骨指标表达、ALP生成及钙结节形成,促进BMSCs成脂指标表达及脂滴的形成。5.UTP刺激使ERK1/2磷酸化增加,P2Y2受体siRNA抑制UTP诱导的ERK1/2磷酸化；阻滞ERK1/2信号通路24h后,UTP对BMSCs成骨和成脂基因表达的影响消失。结论1. BzATP通过P2X7受体激活ERK1/2和JNK信号通路,促进大鼠BMSCs成骨分化、抑制其成脂分化；BzATP可以减少小鼠卵巢切除导致的松质骨丢失。2.UTP通过激活P2Y2受体促进大鼠BMSCs成脂分化、抑制其成骨分化；ERK1/2信号通路介导这个过程的起始阶段。
[Abstract]:Objective to investigate the purine receptor P2X7 and P2Y2 in rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) osteogenic and adipogenic differentiation effect in vitro. Methods 1. (1) receptor expression detection: immunofluorescence staining to detect the expression of BMSCs purinergic receptors P2X7 and P2Y2, the relationship between RT-qPCR and Western-blot receptor expression detection and differentiation the state of cells; (2) to detect cell viability and proliferation: CCK-8 kit to detect the activation effect of purine receptor P2X7 and P2Y2 on BMSCs cell proliferation and cell activity; (3) the osteogenic differentiation of RT-qPCR and Western-blot detection: detection of osteogenic index (RUNX2, ALP and OPN) expression; alizarin red staining and calcium nodules; ALP (alkaline phosphatase) staining ALP generation: (4) adipogenic differentiation test: RT-qPCR and Western-blot detection into fat index (PPARy, FABP4 and Adipsin) expression; oil red O staining, lipid droplet formation; (5) gene silencing Technology: Si RNA silencing P2X7 and P2Y2 receptor, P2X7 receptor and P2Y2 in detection of BMSCs osteogenic and adipogenic differentiation; (6) signal pathway detection:.2. pathway in vivo detection of Western-blot activation of the purinergic receptor P2X7 and its downstream P2Y2 is activated (1) animal model: resection of the osteoporosis model of activation purine receptor P2X7 in vivo after cancellous bone in mouse ovary, the influence of the cortical bone and intramedullary adipose tissue morphological analysis; (2): microCT detection of cortical and trabecular bone parameters; HE staining cancellous bone marrow cavity parameters and lipid droplet formation. The results of BMSCs 1.SD rats on expression of purine expression of P2X7 and P2Y2; decreased in expression of P2Y2 receptor in bone differentiation, and the expression of P2X7 receptor increased gradually; gradually increase in expression of P2Y2 receptor in adipogenic differentiation process, and gradually reduce the expression of P2X7 receptor.2. BzATP Through the activation of the P2X7 receptor to promote BMSCs osteogenic index expression, ALP formation and formation of calcium nodules, inhibit the formation of.P2X7 receptor antagonist siRNA and lipid index and expression of lipid droplets (BBG) completely blocked the effect of.MicroCT BzATP shows that BzATP can reduce the loss due to ovariectomy induced cancellous bone, but no influence of parameters on the cortical bone; HE staining showed that BzATP can increase the ovariectomized mice cancellous bone marrow cavity number and volume, the accumulation of lipid droplets decreased.3. BzATP stimulated ERK1/2 and JNK phosphorylation increased, BBG inhibited BzATP induced ERK1/2 and JNK phosphorylation; block ERK1/2 and JNK signaling pathway, BzATP BMSCs osteogenic and adipogenic gene expression of.4.UTP disappeared (three triphosphate) through the activation of the P2Y2 receptor inhibits BMSCs expression of osteoblast index, ALP generation and formation of calcium nodules, promote BMSCs expression and lipid index of lipid droplet shape .5.UTP stimulation increased phosphorylation of ERK1/2, P2Y2 receptor siRNA inhibits ERK1/2 induced UTP phosphorylation; block ERK1/2 signaling pathway after 24h, UTP of BMSCs osteogenic and adipogenic gene expression disappeared. Conclusion 1. BzATP through activation of P2X7 receptors ERK1/2 and JNK signaling pathway promotes rat osteogenic differentiation of BMSCs, inhibit the adipogenic differentiation; BzATP mice can reduce the OVX induced cancellous bone loss.2.UTP by activation of P2Y2 receptor promotes rat BMSCs adipogenic differentiation, inhibit their osteogenic differentiation; the initial stage of ERK1/2 signaling pathway mediated by this process.

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 黄月琴;王松波;;骨髓间充质干细胞成肌和成脂分化的调控[J];中国生物化学与分子生物学报;2010年07期

2 张国华;屈长青;杨公社;;全反式维甲酸抑制猪脂肪间充质干细胞的成脂分化[J];中国生物化学与分子生物学报;2007年06期

3 潘志宏;韩宁;;P糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响[J];复旦学报(医学版);2010年04期

4 范正伟;张晾;潘杰;;TNF-α缺失小鼠前脂肪细胞成脂分化特征[J];济南大学学报(自然科学版);2013年03期

5 吴伟;季菊玲;王奎栋;李智耀;龚雨琴;季煜华;;去乙酰化酶抑制剂TSA对间充质干细胞C3H10T1/2增殖和成脂分化的影响[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2011年03期

6 王奎栋;李智耀;吴伟;龚雨琴;季煜华;;SAHA抑制间充质干细胞C3H10T1/2的增殖与成脂分化[J];中国生物化学与分子生物学报;2012年06期

7 王新鲁;姬云涛;屈长青;;Rho激酶抑制剂Y-27632对C3H10T1/2细胞增殖与成脂分化的作用[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年07期

8 张金超;刘丹丹;孙静;张大威;申世刚;杨梦苏;;Dy~(3+)对小鼠骨髓基质细胞成骨和成脂分化及成骨细胞横向分化为脂肪细胞的影响[J];科学通报;2008年22期

9 龚雨琴;季煜华;李智耀;王奎栋;;去乙酰化酶抑制剂TSA通过激活ERK和p38抑制间充质干细胞成脂分化[J];中国生物化学与分子生物学报;2012年01期

10 刘革修;朱锦灿;陈小宇;祝爱珍;刘成成;赖菁;;促红细胞生成素通过激活ERK和p38 MAPK抑制小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化[J];中国病理生理杂志;2013年11期

相关会议论文 前4条

1 王玉;朱国英;王建平;李旭芳;翟江龙;;辐射对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及向成骨和成脂分化的影响[A];中华医学会第七次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议论文汇编[C];2013年

2 刘丽忠;任茂文;黄凯;;人脂肪来源基质细胞原代培养和成脂分化[A];第四届华东六省一市整形外科学术会议暨2007年浙江省整形、美容学术会议论文汇编[C];2007年

3 邹玲玲;鲁红云;刘红;李玲玲;舒晓春;孙辽;谢丹红;;GLP-1对人脂肪干细胞增殖、成脂分化及脂代谢的影响[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

4 王平;杨光;李远栋;吴纯标;;荣筋片影响SAMP6鼠成骨-成脂分化关键调控因子的实验研究[A];第二十届全国中西医结合骨伤科学术研讨会、第二届中国医师协会中西医结合医师分会骨伤科学术年会、第十九届浙江省中西医结合骨伤科专业委员会学术年会论文汇编[C];2013年

相关重要报纸文章 前1条

1 记者 白毅;骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化平衡调控机制研究获进展[N];中国医药报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 高红伟;NCoR在骨髓间充质干细胞成脂分化中分子调控机制的实验研究[D];山东大学;2016年

2 宋宝全;人间充质干细胞成脂分化调控机制的研究[D];北京协和医学院;2016年

3 李文凯;嘌呤受体P2X7和P2Y2在大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中的作用[D];华中科技大学;2016年

4 贾兵兵;环腺苷酸信号通路调控人脂肪间充质干细胞成脂分化的作用研究[D];浙江大学;2012年

5 江书忠;猪脂肪沉积关键基因的筛选及锌指蛋白KLF13的功能研究[D];华中农业大学;2014年

6 李大虎;CKIP-1负控间充质干细胞成脂分化研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2012年

7 李海芳;β-肾上腺素受体在小鼠MSCs成骨、成脂分化中的作用[D];清华大学;2010年

8 肖静;p204在3T3-L1细胞成脂分化过程中的表达及功能研究[D];清华大学;2010年

9 胡丽;IGF1通过PPARγ-Axin2-Wnt信号通路促进内源性脂肪干/前体细胞成脂分化[D];华中科技大学;2014年

10 杨晓红;miR-705对绝经后骨质疏松小鼠的骨髓间充质干细胞分化功能异常的调控作用[D];第四军医大学;2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 李晓敏;健脾活骨方不同部位对体外骨髓间充质干细胞分化调节作用的研究[D];中国中医科学院;2015年

2 葛志敏;甲状旁腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响[D];山西医科大学;2015年

3 杜蕾蕾;极低频电磁场对MSCs的作用及其机制研究[D];南京大学;2013年

4 王利娟;抑制Hedgehog信号通路对小鼠胚胎间充质干细胞成脂分化的影响[D];浙江农林大学;2015年

5 曹美霞;过表达RhoA基因对C3H10T1/2细胞成脂分化作用的研究[D];安徽大学;2016年

6 黄艳;基于生物信息技术构建成脂分化分子调控网络数据查询和分析平台[D];西北农林科技大学;2016年

7 叶勖;TLR2/TLR4活化相关微小RNA在人骨髓间充质干细胞迁移、分化中的作用[D];安徽医科大学;2016年

8 张小强;杜仲提取物5-羟甲基-2-糠醛诱导细胞成脂分化的信号途径研究[D];南京中医药大学;2016年

9 郜一飞;植物提取物Embelin对小鼠肥胖的影响及机制研究[D];天津医科大学;2016年

10 叶晶晶;胞外钙离子对猪BMSCs增殖和成脂分化的影响及作用机制[D];华南农业大学;2016年

，

本文编号：1404592