TLRs信号通路和Treg在H.pylori逃避宿主免疫清除和疫苗免疫保护中的作用

发布时间：2018-01-14 19:01

  本文关键词：TLRs信号通路和Treg在H.pylori逃避宿主免疫清除和疫苗免疫保护中的作用　出处：《南昌大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：背景和目的:目前在对H.pylori与机体免疫反应关系及H.pylori疫苗机制的研究多集中在获得性特异性免疫反应,对固有免疫反应在从中所起的作用很少研究,而只有同时研究H.pylori感染和疫苗所诱导的固有免疫反应和获得性免疫反应才能真正阐明H.pylori免疫致病和疫苗免疫保护的机制。Toll样受体(Tol1 1ike receptors,TLRs)是一类与固有免疫密切相关,识别病原体相关分子模式(PAMPs)的膜蛋白分子。TLRs信号通路可通过不同机制参与病原体的免疫致病和疫苗的免疫保护作用。调节性T细胞(Regulatory T-Cells,Treg)是具有调节功能的T细胞群体,其具有免疫抑制作用。CD4+CD25+Treg是Treg中最为重要的亚型,是免疫抑制机制中的关键成分。TLRs信号通路与Treg可相互影响,TLRs信号通路可抵抗Treg引起的免疫抑制,还可通过My D88依赖途径调节Treg的功能。反之,Treg也可降低TLRs刺激的细胞因子的产生。TLRs与Treg相互作用与影响,共同维持着机体免疫系统的平衡。但在H.pylori感染和H.pylori疫苗免疫时TLRs信号通路与Treg之间的相互作用与影响,及它们与H.pylori逃避宿主免疫清除和疫苗免疫保护作用的关系目前尚不清楚。为此,本文研究了H.pylori感染和不同佐剂的H.pylori疫苗接种后小鼠胃肠道局部TLRs信号通路和Treg的变化及其相互关系。从这一新的角度探讨H.pylori逃避宿主免疫清除和H.pylori疫苗的免疫保护机制。方法:1、H.pylori全菌蛋白抗原壳聚糖微球的制备及体外释放特性研究采用Berthold沉淀法制备壳聚糖微球,并根据不同的壳聚糖、不同的沉淀剂、不同冰乙酸浓度、不同p H值和是否进行超声处理来优化壳聚糖微球制备条件;使用扫描电镜及粒径分析仪观察壳聚糖微球的形态及粒径分布;以不同量比的微球与抗原,进行壳聚糖微球包裹H.pylori全菌蛋白抗原;采用BCA蛋白定量法测量分析微球的抗原包裹率、包裹量及释放率。2、TLRs信号通路和Treg在H.pylori感染和疫苗免疫保护中的作用的研究(1)TLRs信号通路和Treg在疫苗免疫保护中的作用的研究:6~8周龄的SPF级BALB/C小鼠随机分为以下9组:(1)空白对照组:PBS溶液;(2)TLR4单抗+空白对照组;(3)CD25单抗+空白对照组;(4)H.pylori抗原+CT;(5)TLR4单抗+H.pylori抗原+CT;(6)CD25单抗+H.pylori抗原+CT;(7)壳聚糖微球-H.pylori抗原;(8)TLR4单抗+壳聚糖微球-H.pylori抗原;(9)CD25单抗+壳聚糖微球-H.pylori抗原;各组于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次,免疫后4周后4组小鼠给予1×109活菌/ml的SS1 H.pylori菌液0.5ml/只进行攻击,隔日一次,共4次。末次攻击后4周,处死小鼠,取标本待测。(2)TLRs信号通路和Treg在H.pylori感染中的作用的研究:6~8周龄的SPF级BALB/C小鼠随机分为以下3组:(1)直接建立H.pylori感染模型;(2)TLR4单抗预处理后建立H.pylori感染模型;(3)CD25单抗预处理后建立H.pylori感染模型。模型的建立:给予含109/ml的SS1 H.pylori菌液,0.5ml/只灌胃,隔日1次,共5次。末次灌胃12周后,处死小鼠,取标本待测。(3)各项指标检测:(1)胃黏膜内H.pylori的检测:采用改良Giemsa染色检测;(2)胃黏膜炎症程度检测:采用HE染色,并按Sakagami法评分;(3)胃黏膜内My D88、NF-κB p65、Foxp3蛋白检测:采用免疫组织化学染色法及Western blot检测;(4)胃黏膜内细胞因子IFN、IL-12、IL-17、IL-4、IL-10含量的检测:采用双抗体夹心ELISA法;(5)血清抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a及唾液中抗H.pylori Ig A含量的检测:采用间接ELISA法检测。结果:1、H.pylori全菌蛋白抗原壳聚糖微球的制备及体外释放特性研究从32种壳聚糖微球制备方案中筛选出了以海得贝壳聚糖为原料、冰乙酸的浓度为1%、硫酸钠为沉淀剂、p H值为5.0、不进行超声处理的最佳制备方案;经扫描电镜(SEM)示微球光滑圆整、致密,粒径分布在1.0-5.0μm;抗原与微球的量比为1:5时包裹率最大,包裹时间为3h时包裹率可达最大,抗原包裹率为79.92%,包裹量为16.47%;体外释放实验表明,总抗原释放率为20.39%,呈缓慢释放状态。2、TLRs信号通路和Treg在H.pylori感染和疫苗免疫保护中的作用的研究(1)两种佐剂的H.pylori疫苗组TLR4阻断小鼠胃黏膜内H.pylori定植密度显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),未予TLR4阻断的疫苗组的定植密度显著低于TLR4阻断的疫苗组(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠的H.pylori定植密度无差别(P0.05)。(2)H.pylori活菌接种后胃黏膜内H.pylori定植密度显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),未予TLR4阻断的感染组的定植密度显著低于TLR4阻断的感染组(P0.05)。(3)两种佐剂的H.pylori疫苗组未予CD25阻断的H.pylori定植密度显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.05),CD25阻断的疫苗组的定植密度显著低于未予CD25阻断的疫苗组(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠的H.pylori定植密度无差别(P0.05)。(4)H.pylori活菌接种后胃黏膜内H.pylori定植密度显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),CD25阻断的感染组H.pylori定植密度显著低于未予CD25阻断的感染组(P0.05)。(5)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是TLR4阻断或未阻断的胃粘膜炎症程度显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.05-0.001),TLR4阻断的疫苗组胃黏膜炎症程度显著低于未予TLR4阻断的疫苗组(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠的胃粘膜炎症程度无差别(P0.05)。(6)H.pylori活菌接种后胃黏膜的炎症程度显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.05-0.001),TLR4阻断的感染组胃黏膜的炎症程度显著低于未予TLR4阻断的感染组(P0.05)。(7)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是CD25阻断或未阻断的胃黏膜炎症程度显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),CD25阻断的疫苗组胃黏膜的炎症程度显著高于未予CD25阻断的疫苗组(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠胃黏膜炎症程度无差别(P0.05)。(8)H.pylori活菌接种后无论是CD25阻断或未阻断的胃黏膜炎症程度显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),CD25阻断的感染组胃黏膜的炎症程度显著高于未予CD25阻断的感染组(P0.05)。(9)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是TLR4阻断或未阻断的胃黏膜内My D88、NF-κB p65、Foxp3表达显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.01-0.001),未予TLR4阻断的疫苗组胃黏膜内My D88、NF-κB p65表达显著高于TLR4阻断的疫苗组(P0.05),免疫组化法测得未予TLR4阻断的疫苗组胃黏膜内Foxp3表达显著低于TLR4阻断的疫苗组(P0.05),Western blot测得未予TLR4阻断的疫苗组与TLR4阻断的疫苗组胃黏膜内Foxp3表达无明显差异(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内My D88、NF-κB p65、Foxp3表达无差别(P0.05)。(10)H.pylori活菌接种后无论是TLR4阻断或未阻断的胃黏膜内My D88、NF-κB p65、Foxp3表达显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.05-0.001),未予TLR4阻断的感染组胃黏膜内My D88、NF-κB p65表达显著高于TLR4阻断的感染组(P0.05),未予TLR4阻断的感染组胃黏膜内Foxp3表达显著低于TLR4阻断的感染组(P0.05)。(11)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是CD25阻断或未阻断的胃黏膜内My D88、NF-κB p65、Foxp3表达显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),未予CD25阻断的疫苗组胃黏膜内My D88、NF-κB p65表达显著低于CD25阻断的疫苗组(P0.05),未予CD25阻断的疫苗组胃黏膜内Foxp3表达显著高于CD25阻断的疫苗组(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内My D88、NF-κB p65、Foxp3表达无差别(P0.05)。(12)H.pylori活菌接种后无论是CD25阻断或未阻断的胃黏膜内My D88、NF-κB p65、Foxp3表达显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.01-0.001),未予CD25阻断的感染组胃黏膜内My D88、NF-κB p65表达显著低于CD25阻断的感染组(P0.05),未予CD25阻断的感染组胃黏膜内Foxp3表达显著高于CD25阻断的感染组(P0.05)。(13)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是TLR4阻断或未阻断的胃黏膜内TH1和TH17细胞因子IFN、IL-12、IL-17含量显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.05-0.001),以CT为佐剂组无论是TLR4阻断或未阻断的胃黏膜内TH2细胞因子IL-4、IL-10含量显著低于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.05),以壳聚糖微球为佐剂组无论是TLR4阻断或未阻断的胃黏膜内IL-4含量显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.05),TLR4阻断的疫苗组胃黏膜内IL-10含量显著高于未阻断的空白对照组(P0.05),与TLR4阻断的空白对照组无明显差别(P0.05),未予TLR4阻断的疫苗组胃黏膜内IL-10含量与TLR4阻断和未阻断的空白对照组无明显差别(P0.05)。未予TLR4阻断的疫苗组胃黏膜内TH1和TH17细胞因子IFN、IL-12、IL-17含量显著高于TLR4阻断的疫苗组(P0.05),未予TLR4阻断的疫苗组与TLR4阻断的疫苗组胃黏膜内TH2细胞因子IL-4、IL-10含量无明显差异(P0.05)。TLR4阻断以壳聚糖微球为佐剂组胃黏膜内IFN、IL-12、IL-17含量无差异(P0.05),TLR4阻断以CT为佐剂组胃黏膜内IFN含量显著高于以壳聚糖微球为佐剂组(P0.05),IL-12、IL-17含量无差异(P0.05)。(14)H.pylori活菌接种后无论是TLR4阻断或未阻断的胃黏膜内TH1和TH17细胞因子IFN、IL-12、IL-17含量显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.05-0.001),胃黏膜内TH2细胞因子IL-4、IL-10含量显著低于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.01)。未予TLR4阻断的感染组胃黏膜内TH1和TH17细胞因子IFN、IL-12、IL-17含量显著高于TLR4阻断的感染组(P0.05-0.001),TLR4阻断与未阻断组胃黏膜内TH2细胞因子IL-4、IL-10含量无明显差异(P0.05)。(15)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是CD25阻断或未阻断的胃黏膜内TH1和TH17细胞因子含量显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),以CT为佐剂组无论是CD25阻断或未阻断的胃黏膜内TH2细胞因子含量显著低于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.05-0.001),以壳聚糖微球为佐剂组无论是CD25阻断或未阻断的胃黏膜内IL-4含量显著低于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.05),而胃黏膜内IL-10含量无明显差异(P0.05)。未予CD25阻断的疫苗组胃黏膜内IFN、IL-17含量显著低于CD25阻断的疫苗组(P0.05),以壳聚糖微球为佐剂组未予CD25阻断的胃黏膜内IL-12含量显著低于CD25阻断的(P0.05),而以CT为佐剂组中两者胃黏膜内IL-12含量无明显差别(P0.05)。疫苗组CD25阻断与未阻断的胃黏膜内IL-4含量无明显差异(P0.05),未阻断的疫苗组的胃黏膜内IL-10含量显著高于CD25阻断的疫苗组(P0.05-0.01)。CD25阻断以CT和壳聚糖微球为佐剂组胃黏膜内IL-12、IL-17含量无差异(P0.05),CD25阻断以CT为佐剂组胃黏膜内IFN含量显著高于以壳聚糖微球为佐剂组(P0.05)。CD25阻断以壳聚糖微球为佐剂组胃黏膜内TH2细胞因子含量显著高于以CT为佐剂组(P0.05)。(16)H.pylori活菌接种后无论是CD25阻断或未阻断的胃黏膜内TH1和TH17细胞因子含量显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),胃黏膜内TH2细胞因子含量显著低于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.01-0.001)。未予CD25阻断的感染组胃黏膜内TH1和TH17细胞因子含量显著低于CD25阻断的感染组(P0.05-0.001),未阻断感染组胃黏膜内IL-10含量显著高于阻断感染组(P0.05),而两者胃黏膜内IL-4含量无明显差异(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠胃黏膜内TH1和TH17细胞因子含量无差别(P0.05)。以壳聚糖微球为佐剂组胃黏膜内TH2细胞因子含量显著高于以CT为佐剂组(P0.05)。(17)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是TLR4阻断或未阻断的抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),TLR4阻断与未阻断组血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量无明显差异(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量无差别(P0.05)。(18)H.pylori活菌接种后无论是TLR4阻断或未阻断的血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),感染组TLR4阻断与未阻断组血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量无明显差异(P0.05)。(19)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是CD25阻断或未阻断的血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),疫苗组CD25阻断与未阻断组血清中抗H.pylori Ig G含量无明显差异(P0.05),CD25阻断疫苗组Ig G1、Ig G2a含量显著高于未阻断疫苗组(P0.05-0.001)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量无差别(P0.05)。(20)H.pylori活菌接种后无论是CD25阻断或未阻断的抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),感染组CD25阻断与未阻断组血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1含量无明显差异(P0.05),CD25阻断感染组Ig G2a含量显著高于未阻断感染组(P0.05)。(21)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是TLR4阻断或是未阻断组抗H.pylori Ig A含量显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.05),TLR4阻断疫苗组唾液中抗H.pylori Ig A含量显著高于未阻断疫苗组(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠抗H.pylori Ig A含量无差别(P0.05)。(22)H.pylori活菌接种后无论是TLR4阻断或是未阻断组抗H.pylori Ig A含量显著高于TLR4阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),TLR4阻断感染组唾液中抗H.pylori Ig A含量显著低于未阻断感染组(P0.05)。(23)两种佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠无论是CD25阻断或是未阻断组抗H.pylori Ig A含量显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.001),以CT为佐剂疫苗组CD25阻断的唾液中抗H.pylori Ig A含量显著高于未阻断疫苗组(P0.01),以壳聚糖微球为佐剂疫苗组CD25阻断的唾液中抗H.pylori Ig A含量显著低于未阻断疫苗组(P0.05)。不同佐剂的H.pylori疫苗接种小鼠抗H.pylori Ig A含量无差别(P0.05)。(24)H.pylori活菌接种后无论是CD25阻断或是未阻断组抗H.pylori Ig A含量显著高于CD25阻断和未阻断的空白对照组(P0.01),CD25阻断感染组唾液中抗H.pylori Ig A含量显著低于未阻断感染组(P0.05)。结论:1、本研究筛选的壳聚糖微球制备条件所制备的壳聚糖微球对H.pylori全菌蛋白抗原具有较高的包裹率和较好的控释效果。2、TLR4阻断可降低H.pylori疫苗的免疫保护率,增加H.pylori自然感染小鼠胃黏膜内H.pylori定植密度;而CD25阻断可增加H.pylori疫苗的免疫保护率,降低H.pylori自然感染小鼠胃黏膜内H.pylori定植密度。3、TLR4阻断可减轻H.pylori疫苗接种小鼠和H.pylori感染小鼠胃黏膜炎症程度;而CD25阻断可加剧H.pylori疫苗接种小鼠和H.pylori感染小鼠胃黏膜炎症程度。4、TLR4阻断可下调My D88的表达和抑制NF-κB活化,增加CD4+CD25+Foxp3+Treg的数量,CD25阻断可上调My D88的表达和促进NF-κB活化,降低CD4+CD25+Foxp3+Treg的数量,这可能是它增强H.pylori疫苗的免疫保护作用、降低H.pylori自然感染小鼠胃黏膜内H.pylori定植密度的机制。5、TLR4阻断可降低TH1及TH17细胞因子水平,但对TH2细胞因子无影响,CD25阻断可增加TH1及TH17细胞因子水平,降低TH2细胞因子。6、TLR4及CD25阻断对血清中抗H.pylori Ig G无影响,CD25阻断可增加血清中抗H.pylori Ig G1、Ig G2a水平。7、TLR4阻断可增加唾液中抗H.pylori Ig A含量水平,CD25阻断可降低唾液中抗H.pylori Ig A含量水平。8、以壳聚糖微球为佐剂的H.pylori疫苗与传统的佐剂CT为佐剂的H.pylori疫苗对H.pylori感染具有同样的免疫保护作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
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本文编号：1424865