RIP3在H7N9禽流感病毒感染和炎性疾病小鼠模型中的作用及机制研究

发布时间：2018-01-19 23:22

  本文关键词： H7N9禽流感病毒 RIP3 细胞程序性坏死 细胞因子风暴 caspase-1 RIP3 急性结肠炎 急性胰腺炎 小鼠模型 细胞程序性坏死 组织修复　出处：《第二军医大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIP3/RIPK3)是RIP家族中的一员,基因位于人第14号染色体上,由518个氨基酸残基组成;其N端具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,为其介导细胞程序性坏死(programmed necrosis or necroptosis)所必需。细胞程序性坏死是一种经由RIP3及其下游底物分子MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)调控的促炎症反应细胞死亡方式,并且在感染性疾病以及无菌性炎症性疾病中发挥重要作用。RIP3与其上游分子RIP1通过RHIM(RIP-homotypic interaction motif)结构相互作用组装成为坏死复合体,该坏死复合体上承众多刺激,诸如死亡受体、Toll样受体、病原分子或细胞损伤等所接受或产生的信号,下游募集MLKL并使之激活,活化的MLKL形成寡聚体迁移至胞膜一侧,最终导致细胞破裂,细胞内容物,包括危险相关分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMPs)等的释放引发炎症反应。然而,近来越来越多的研究显示RIP3在介导经典的程序性坏死信号通路之外也发挥坏死非依赖性功能。本研究采用RIP3基因敲除(RIP3-/-)小鼠建立感染模型和无菌性炎性疾病模型,分别就RIP3在H7N9禽流感病毒感染以及葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导急性结肠炎、雨蛙素诱导急性胰腺炎小鼠模型中的作用及其机制进行探讨,从而为全面认识RIP3的生物学功能、深入理解H7N9禽流感病毒感染致病和结肠炎、胰腺炎等疾病的发病机制以及防治措施提供理论和实验依据。第一部分:RIP3敲除减轻小鼠H7N9禽流感病毒感染后炎症反应H7N9禽流感病毒感染引发急性、高传染性呼吸系统病变,重症患者表现为重症肺炎,并快速进展出现急性呼吸窘迫综合征。患者肺部病理损伤以气道上皮细胞死亡和结构破坏为特点。事实上,H7N9病毒感染后会造成肺组织和血液中大量细胞因子的释放,即细胞因子风暴(cytokine storm)的产生,弥漫性的炎症浸润造成细支气管-肺泡结构破坏以及功能障碍。细胞程序性坏死是新近发现的受RIP3及其下游信号分子MLKL调控的促炎症反应细胞死亡方式;此外,研究指出RIP3在病毒、细菌感染造成的组织坏死中同样发挥关键性的调控作用。但是,目前对于H7N9禽流感病毒感染后细胞因子风暴发生的确切机制以及特定疾病背景下RIP3功能的研究仍不十分清楚。本研究中,我们采用RIP3-/-小鼠滴鼻感染H7N9禽流感病毒(A/Fujian/S03/2015),以探索RIP3在H7N9病毒感染后细胞因子风暴发生中的作用和机制。研究发现:病毒感染后,RIP3-/-小鼠生存率显著高于野生型小鼠并且体重减轻程度明显低于野生组;此外,小鼠肺组织切片行H.E.染色显示RIP3-/-小鼠肺组织在水肿、炎症细胞浸润和肺泡破坏程度方面均明显轻于野生型小鼠组。与之相一致的是RIP3-/-小鼠肺泡灌洗液中interleukin-1β(IL-1β),interleukin-6(IL-6),RANTES(regulated upon activation,normal T cell expressed and secreted)和MIP 1α(macrophage induced protein-1α)等细胞因子也呈现出较低的水平。值得指出的是,此过程中伴随着caspase-1/IL1β信号通路的活化,相反,经典的RIP3/MLKL细胞程序性坏死途径则未见其在此病毒感染过程中发挥影响。以上结果揭示了RIP3参与H7N9禽流感病毒感染后炎症反应的发生,并且RIP3的缺失能够通过负向调控caspase-1/IL1β通路活性而减轻炎症反应;提示了RIP3具有坏死非依赖性功能,为探究其功能多样性提供了理论及实验依据。此外,也为流感病毒感染相关性疾病的治疗提供了新的思路。第二部分:RIP3在炎性疾病小鼠模型中的作用及机制研究RIP家族成员在细胞坏死和炎症方面扮演重要角色。此前研究指出细胞坏死将会恶化组织损伤;此外,报道也指出RIP3缺失在一定程度上能够逆转细胞坏死引发的炎症性病理损害,在众多小鼠疾病模型,如急性胰腺炎、动脉粥样硬化、肾缺血再灌注损伤和心肌梗死等中,失活RIP3能够减轻疾病损害。但是细胞坏死在人类炎性疾病中的具体作用仍不十分清楚,而且越来越多的研究结果也提示RIP3有着更为复杂多样的功能。本研究中,我们采用RIP3-/-小鼠分别建立DSS诱导急性结肠炎和雨蛙素诱导急性胰腺炎模型以探索无菌性炎性疾病的发病机制以及RIP3在疾病进程中的作用。研究发现,在DSS诱导的急性结肠炎中,RIP3-/-小鼠疾病症状明显加重,表现为体重减轻、腹泻和便血;组织病理学显示RIP3-/-小鼠结肠短缩及肠黏膜破坏更为严重。然而,RIP3-/-小鼠结肠组织中IL-6和IL-1β表达水平显著降低,此外,组织修复相关因子,包括IL-22、Cox2、Ereg和MMP10等的表达明显减低。以上结果揭示:RIP3缺失将导致DSS诱导的结肠炎病理损伤更为恶化,同时造成组织损伤修复反应的缺陷,即RIP3在DSS诱导的结肠炎症损害中发挥保护性作用。另一方面,在雨蛙素诱导急性胰腺炎模型中,RIP3-/-小鼠和野生型小鼠在胰腺组织损伤程度和血清淀粉酶水平方面均未见显著差异,即此疾病模型中RIP3既未表现出有害性一面,也未发挥保护性作用。综合以上研究结果,RIP3参与机体的众多生理病理进程并可能发挥迥然相异的作用。除介导细胞程序性坏死这一经典信号通路外,RIP3同时具有坏死非依赖性的功能,即在促进组织修复方面有着重要作用。事实上其具体功能表现尚需依据机体特定的生理病理状态而定。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R511.7;R-332

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本文编号：1445910