MRP1转运体通过谷胱甘肽化修饰调控白介素-1β分泌的研究

发布时间：2018-02-08 21:23

本文关键词： 白介素-1β MRP1转运体 SNARF1染料脂多糖　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：细胞因子风暴(cytokine storm)是机体多种细胞因子如白介素-1β(IL-1β)、IL-6和γ-干扰素(IFN-γ)等迅速大量产生的现象,可引发多器官衰竭。其中,IL-1β是一种非常重要的促炎性细胞因子。在多种炎性疾病例如家族性地中海热、家族性寒冷型自身炎症综合征、先天性多系统炎性疾病和高免疫球蛋白D综合征,以及髓性白血病中IL-1p分泌升高。对IL-1β的分泌机制进行深入研究,对于临床如何控制细胞因子风暴将具有重要的指导意义。关于IL-1β的分泌,目前所知有限。IL-1β有两种形式：首先在胞浆内以无活性的proIL-1β形式(31kDa)被翻译出来,然后被caspase-1剪切成有活性的matureIL-1β(17kDa)并分泌到胞外。前人的研究已经证实IL-1β缺乏信号肽,无法通过内质网-高尔基体经典分泌途径分泌到胞外。细胞免疫荧光染色显示IL-1β均匀分布在细胞浆中,我们推测胞膜上的广泛存在的各类转运体(transporters)是IL-1p的主要分泌途径。本研究的主要目的是筛选与IL-1p分泌相关的转运体,并对相关分泌机制进行较为深入的研究。方法1白介素-1β在单核、巨噬及中性粒细胞中分泌检测1.1获取人源性和鼠源性的单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞获取人外周血原代单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞；使用丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)分化THP-1细胞得到人源性巨噬细胞；获取小鼠腹腔和骨髓巨噬细胞；培养小鼠巨噬细胞株RAW 264.7和J774A.1细胞；获取小鼠腹腔和骨髓中性粒细胞；培养和分化HL60细胞成为人源性中性粒细胞。使用Wright-Giemsa染色和流式细胞术检测获取的细胞纯度。1.2 IL-1β检测使用1μg/ml LPS 4h和/或ATP1mM 45min进行细胞刺激,设置三组：无处理细胞组(Untreated cells, UT), LPS单刺激组(L), LPS+ATP双单刺激组(LA)。使用ELISA, Western Blotting和细胞免疫荧光法进行上清IL-1p以及胞浆内IL-1p检测。2筛选白介素-1p分泌相关的转运体2.1筛选可抑制IL-1β分泌的转运体在人外周血原代巨噬细胞、THP-1细胞分化来源巨噬细胞和FVB wild type (FVBwt)小鼠腹腔巨噬细胞中,使用MRP1、BCRP、P-gp、OATP1B1和MATE转运体抑制剂进行IL-1p分泌抑制实验。2.2 MRPl转运体功能验证和表达检测使用转运体抑制剂处理细胞,将10μg/ml终浓度的SNARF1孵育细胞30分钟后胞吐7小时,使用流式细胞仪检测SNARF1胞浆内滞留程度验证MRP1转运体功能。使用流式细胞仪,Western Blotting和细胞免疫荧光法检测MRP1蛋白的表达。2.3 MRPl基因敲除小鼠中IL-1p分泌检测同性别、同年龄的FVBwt小鼠作为MRP1 Knock Out (MRP1ko)小鼠的阴性对照。培养FVBwt和MRP1ko 小鼠骨髓巨噬细胞,进行IL-1p分泌检测。3阻滞白介素-1β与炎症小鼠生存率的关系3.1腹膜炎小鼠造模调整LPS浓度,分别设置未处理组、1mg/kg组、1.5mg/kg组、2mg/kg组、5mg/kg组、10mg/kg组和50mg/kg组,每组1ml液体注射到小鼠腹腔中。3.2 MRP1腹膜炎小鼠体内细胞因子浓度检测使用LPS lmg/kg腹腔注射小鼠,设置未处理组、刺激6小时组、刺激2天组、刺激6天组、刺激13天组和刺激27天组。获取小鼠外周血和小鼠腹腔液的样本,检测以下32种细胞因子：Eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、 IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、 IL-17、IP-10、KC、LIF、LIX、MCP-1、M-CSF、MIG、MIP-1α、 MIP-1β、MIP-2、 RANTES、TNF-α和VEGF。3.3小鼠生存率实验使用FVBwt小鼠检测LPS致死剂量,设置LPS 5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg和50mg/kg组进行浓度检测。所有小鼠均注射LPS,然后用anakinra 745mg/kg或/和IL-18 BPd lmg/kg双重拮抗IL-1p或/和IL-18,同时设置未注射任何拮抗剂组作为对照,观察小鼠生存情况。4胞浆内白介素-1p谷胱甘肽化修-饰检测使用BioGEE对胞内所有谷胱甘肽化的蛋白进行标记,裂解细胞。使用羊抗人IL-1β抗体通过免疫共沉淀pull-down细胞裂解液中的IL-1β蛋白,兔抗人IL-1p抗体Western Blotting验证pull-down效果。使用streptavidin-HRP进行Western Blotting,检测胞内IL-1β的谷胱甘肽化水平。结果1白介素-1β在单核、巨噬及中性粒细胞中分泌情况1.1成功获取了各类人源性和鼠源性的单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞我们成功获取人外周血原代单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞；使用PMA分化THP-1细胞得到了人源性巨噬细胞；获取了小鼠腹腔和骨髓巨噬细胞；培养了小鼠巨噬细胞株RAW264.7和J774A.1细胞；获取了小鼠腹腔和骨髓中性粒细胞；培养并分化HL60细胞成为人源性中性粒细胞。1.2 IL-1p分泌情况单核细胞和中性粒细胞仅需要LPS单刺激便可以分泌IL-1β,原代巨噬细胞需要LPS+ATP双重刺激才可以分泌IL-1β。THP-1细胞株来源的人巨噬细胞分泌IL-1p的能力极为强大,上清中可同时见大量matureIL-1β和proIL-1β被分泌出来。THP-1分化来源的巨噬细胞、J774A.1细胞株和RAW264.7细胞株可以分泌proIL-1β.2抑制MRPl转运体降低白介素-1β分泌2.1 MRP1转运体可抑制IL-1β分泌MRP1、BCRP、P-gp、OATP1B1和MATE转运体抑制剂发现,抑制MRP1功能后IL-1β分泌显著降低。2.2 MRP1转运体功能正常并在细胞膜上分布SNARF1胞浆内滞留实验表明MRP1转运体抑制剂确实特异性地抑制MRP1转运体功能。使用流式细胞术,Western Blotting和细胞免疫荧光法均在目标细胞中检测MRP1蛋白的表达,MRP1转运体分布在细胞膜上。2.3 MRP1基因敲除小鼠分泌matureIL-1β、能力降低在小鼠M0骨髓巨噬细胞中,MRPlko和FVBwt小鼠比较,MRPlko小鼠M0细胞分泌matureIL-1β能力低于FVBwt小鼠M0细胞,两者呈显著统计学差异(P=0.044)。3阻滞白介素-1p提高炎症小鼠生存率3.1腹膜炎小鼠造模成功LPS 1mg/kg可以成功引发小鼠腹膜炎,这个剂量注射后的小鼠可以存活超过一个月。5mg/kg和10mg/kg属于亚致死剂量,而50mg/kg属于致死剂量。患有腹膜炎的小鼠,许多种类的炎症因子都上升,包括IL-1β。3.2小鼠生存率实验选取LPS 15mg/kg用于小鼠生存率检查。与未拮抗的对照组比较,anakinra 745mg/kg拮抗组、anakinra 745mg/kg和IL-18 BPd lmg/kg双重拮抗组均能改善小鼠生存率。因小鼠样本过少,组间数据比较未能得到显著性差异。4胞浆内IL-1p可被谷胱甘肽化修饰兔抗人IL-1β抗体的Western Blotting结果表明目标蛋白已被成功pull down, streptavidin-HRP抗体的Western Blotting结果表明胞内IL-1p被谷胱甘肽化。结论(1)单核细胞、中性粒细胞仅需要LPS单刺激便可以分泌matureIL-1β,巨噬细胞需要LPS+ATP双重刺激才可以分泌matureIL-1β。THP-1分化的人源巨噬细胞、小鼠巨噬细胞株J774A.1细胞和RAW264.7细胞可以分泌proIL-1β。(2)MRP1转运体分布在细胞膜上,是matureIL-1β的分泌通路之一。(3)炎症状态下,matureIL-1β分泌增多。对matureIL-1β进行阻滞,可提高炎症小鼠的生存率。(4)细胞内IL-1p可被谷胱甘肽化修饰。谷胱甘肽化修饰后的蛋白是MRP1转运体的运输底物。MRP1转运体可能通过谷胱甘肽化修饰调节IL-1β的分泌
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363

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